Elektronově mikroskopická diagnostika cirkovirové infekce papoušků

B. ŠMÍD,1 L. VALÍČEK,1 V. TUKAČ,2 H. KŘÍŽ3 1Výzkumný ústav veterinárního lékařství Brno 2Klinika chorob plazů, ptáků a drobných savců, Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity Brno 3Brno-Líšeň Veterinářství 2004;54:151-154

SOUHRN
Šmíd B., Valíček L., Tukač V., Kříž H. Elektronově mikroskopická diagnostika cirkovirové infekce papoušků. Veterinářství 2004;54:151-154.
Elektronově mikroskopickým vyšetřením peří dvou papoušků postižených degenerací peří a v jednom případě ještě přerůstáním zobáku a drápů byly prokázány cirkoviry, tj. původci PBFD. Potvrdilo se, že použitá metoda negativního barvení dřeně papouščího peří je s ohledem na rychlost a jednoduchost vhodnou diagnostickou metodou.

SUMMARY
Šmíd B., Valíček L., Tukač V., Kříž H. Diagnostics of psittacine circovirosis by electron microscopy. Veterinářství 2004;54:151-154.
Circovirus as a causative agent of PBFD was detected in feathers of two parrots suffering from feather dystrophy and beak overgrowth in one of them, respectively. The negative staining method was confirmed to be suitable and simple for fast diagnostics of PBFD.

Cirkovirová infekce papoušků označovaná anglickou zkratkou PBFD (Psittacine Beak and Feather Disease) byla poprvé popsána v roce 19811 a detailněji pak v roce 1984.2 Předpokládaná virová etiologie PBFD byla však potvrzena až později a virus je dnes zařazen do čeledi Circoviridae společně s cirkoviry prasat, anemií kuřat, s cirkoviry holubů, kanárů, pěnkav, racků a pštrosů.3-9 Cirkoviry jsou dosud nejmenší ze známých virů, u nichž se běžně uvádí velikost 15 – 17 nm, ale někteří autoři uvádějí velikost až 20 nm.10 Výjimku tvoří cirkovirus anémie kuřat, který měří přes 20 nm.11
Cirkoviry mají jednořetězcovou cirkulární DNA a její velikost je kolem dvou kilobází. PBFD virus nelze dosud kultivovat na buněčných kulturách. Virus vyvolává nejčastěji akutní onemocnění u mladých papoušků do dvou měsíců stáří, ale onemocnění se může vyskytnout i u starých jedinců, kde většinou probíhá v chronické formě. Charakteristické jsou příznaky s relativně symetrickou dystrofií a ztrátou peří, deformacemi zobáku a eventuálně úhynem. Změny na zobáku nemusí být vždy vyvinuty, což zřejmě závisí na druhu a dalších, dosud nezjištěných faktorech. Někteří ptáci hynou krátce po tom, co se objevila malformace peří, jiní mohou žít i několik let bez peří. Onemocnění se může projevovat i zánětem jater. U mláďat může docházet i k náhlým úhynům bez klinických příznaků onemocnění. Onemocnění postihuje asi 30 druhů papoušků, avšak skutečný rozsah hostitelů není dosud znám.
Patologické změny při PBFD byly popsány jak metodami světelné, tak i elektronové mikroskopie. Projevují se dystrofií peří a zobáku s četnými nekrózami epidermálních buněk. Dystrofické změny představují kombinované nekrózy epidermálních buněk, epidermální hyperplazie a hyperkeratózy.2 Histologickým vyšetřením postižených folikulů a kůže se prokazuje zánět a nekróza v distální dřeni a v epidermálních zónách vyvíjejícího se peří.2,12 Podobné mikroskopické léze byly popsány na zobáku s degenerací a nekrózou epiteliálních buněk jak v bazální, tak i v intermediální buněčné vrstvě.2 Jak intranukleární, tak i intracytoplazmatické inkluze v bazální vrstvě, ve stratum spinosum dřeně nebo folikulárního epitelu byly popsány a jsou považovány za příznačné pro toto onemocnění.2,12 Intracytoplazmatické inkluze byly prokázány v okolí nekrotických změn zobáku a v thymu a Fabriciově burze. Tyto změny jsou spojovány s oblastmi lymfoidní atrofie a buněčné nekrózy. Elektronově mikroskopickým vyšetřením byly prokázány cytoplazmatické inkluze složené z elektronově tmavých granul 17 – 22 nm v průměru, která tvoří parakrystaly.2 Latimer et al.13 prokázali extrakutánní virové inkluze u 34 ptáků z 35 vyšetřovaných. Jedná se o inkluze v různém zastoupení v zažívacím traktu, v zobáku, ve Fabriciově burze, v thymu, v kostní dřeni, v Kupferových buňkách jater, ve slezině a štítné žláze. Inkluze ve střevech jsou v jádrech epiteliálních buněk, v ostatních uvedených tkáních jsou převážně v cytoplazmě makrofágů. Latimer et al.13 také prokázali imunohistochemicky, že intranukleární a intracytoplazmatické bazofilní inkluze, zjišťované při barvení HE, obsahují PBFD virový antigen. Výrazná destrukce Fabriciovy burzy a perzistence viru v thymu zřejmě vyvolávají imunosupresivní účinky. Postižení ptáci pak mohou podlehnout současně probíhajícím bakteriálním, chlamydiovým a virovým infekcím.
K diagnostice slouží kromě klinického a patologicko-histologického nálezu také další metody. Je to elektronově mikroskopická metoda negativního barvení, kterou prokazovali různí autoři při PBFD virové částice ikosahedrální symetrie různé velikosti od 14 do 20 nm,10,14,15a,16 K průkazu protilátek se využívá hemaglutinačně-inhibiční test,17 k průkazu viru imunoperoxidázové reakce16 a k průkazu virové nukleové kyseliny metoda PCR.18 aj. Stručné literární přehledy o PBFD publikovala ve Veterinářství již dříve Grymová.19,20
Cílem práce bylo ověřit a zavést rychlou diagnostiku PBFD z klinického materiálu s využitím elektronově mikroskopické metody negativního barvení.

Materiál a metody
1. Papoušci: K vyšetření byly získány vzorky peří ze dvou papoušků postižených degenerací a symetrickým vypadáváním peří. Jednalo se o kakadu bílého (Cacatua alba) a agapornise růžohrdlého (Agapornis roseicollis).
2. Elektronová mikroskopie: Z jednotlivých degenerovaných per byly zhotovovány preparáty pro elektronově mikroskopický průkaz viru metodou negativního barvení. Dřeňové konce per byly macerovány při opakovaném stlačení pinzetou v několika kapkách destilované vody. Po maceraci byla na suspenzi přiložena nosná elektronově mikroskopická síťka potažená formwarovou blankou, která byla pouhlíkovaná. Asi po 10 vteřinách byla síťka stažena, přebytečná tekutina odsáta proužkem filtračního papíru a na síťku bylo nakápnuto barvivo (2% vodný roztok molybdenanu amonného, pH 7,0). Po několika vteřinách bylo barvivo odsáto filtračním papírkem a preparát byl vyšetřován elektronovým mikroskopem PHILIPS EM 208.

Výsledky
1. Anamnéza
a) Kakadu bílý byl samec, stáří dvou let. Jeho majitel zakoupil více papoušků kakadu od dovozce papoušků k dalšímu odchovu. Všichni ptáci byli v dobrém výživném stavu, bez alterace peří. Po šesti týdnech se u vyšetřovaného jedince počala objevovat ztráta peří na hlavě, především na chocholce a v okolí očí. Za další čtyři týdny změny postihly i krycí peří na trupu a některá dlouhá pera na křídlech i ocasu. Chovatel podával po dobu jednoho měsíce preparát obsahující komplex vitaminů a aminokyselin bez zřejmého účinku. V průběhu vyšetřování tohoto papouška se u ostatních čtyř zakoupených papoušků kakadu objevily obdobné problémy spojené navíc s přerůstáním zobáku a drápů. U těchto jedinců docházelo postupně k odlomení špiček zobáků, anorexii, takže ptáci museli být utraceni.
b) Druhý papoušek, agapornis růžohrdlý, byl jako mládě zakoupen ve Zverimexu do domácnosti. Od počátku bylo pozorováno přerůstání zobáku, kdy každých šest týdnů byla prováděna korekce. Pokusy o terapeutické ovlivnění vitaminy a aminokyselinami byly neúspěšné. Poslední tři měsíce života nastalo vypadávání peří spolu s jeho degenerativními změnami a papoušek byl utracen ve stáří 1,5 roku a vyšetřen elektronově mikrosopickou metodou negativního barvení.

2. Elektronová mikroskopie
Metodou negativního barvení byly v suspenzích získaných z dřeňových konců per prokázány u obou papoušků ikozahedrální částice odpovídající svou strukturou cirkovirům. Jejich velikost kolísala kolem 18 nm. Virové částice se objevovaly buď ojediněle, nebo ve shlucích.

Diskuze a závěr
Dva vyšetřovaní papoušci, ve stáří 1,5 a 2 roky, byli postiženi dystrofickými změnami peří. U jednoho z nich došlo navíc i k přerůstání zobáku a drápů. Změny odpovídaly v literatuře popsanému onemocnění PBFD.2,21 I když je toto onemocnění papoušků známo více než dvacet let, jeho diagnostika se stále vyvíjí. Ve světě se používá řada laboratorních metod jako histologie, hemaglutinace, hemaglutinačně inhibiční test, imunohistochemický průkaz,2,16 elektronově mikroskopický průkaz viru15,10 a polymerázová řetězová reakce – PCR.18 Také v našich podmínkách se využívají některé z těchto metod. Podle údajů Grymové (www.amazonia.cz) je využívána metoda PCR v cenové relaci asi 1 500 Kč za jedno vyšetření. Jako alternativní diagnostická metoda se u nás nabízí elektronově mikroskopický průkaz cirkoviru z postiženého peří tak, jak se používá ve světě.15 Vyšetření je také cenově výhodnější (manipulační poplatek 300 Kč) a výsledek je možno získat během jedné hodiny. Elektronová mikroskopie má však svou diagnostickou hodnotu pouze v pozitivním případě, tj. při průkazu virových částic ve vyšetřovaném vzorku. Při vyšetřování může také prokázat i jiné viry, jako např. polyomaviry, které vyvolávají u papoušků podobné klinické onemocnění jako cirkoviry a které jsme v poslední době diagnostikovali (dosud nepublikované sdělení). Při negativním elektronově mikroskopickém nálezu nemůžeme jednoznačně vyloučit onemocnění, a proto je v těchto případech indikováno vyšetření citlivější metodou PCR.

Literatura:
1. Perry R. A. Psittacine beak and feather disease. Proc of Vet Science Aviary and Caged Bird Medicine. Sydney, 1981;55:81-87.
2. Pass D. A., Perry R. A. The pathology of psittacine beak and feather disease. Aust Vet J 1984;61:69-74.
3. Tischer I., Gerdelblom H. et al. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA. London; Nature, 1982;295:64-66.
4. Yuasa N., Taniguchi T., Yoshida I. Isolation and some characteristics of an agent including anemia in chicks. Avian Diseases 1979;23:366-385.
5. Woods L. W., Latimer K. S., Barr B. C., Niagro F. D., Nordhausen R., Campagnoli R. P., Nordhausen R. W., Castro A. E. Circovirus-like infection in a pigeon. J Vet Diagn Invest 1993; 5: 609-612.
6. Goldsmith T. L. Documentation of passerine circoviral infection (Abstract). Proceedings of the Annual Conference of the Association of Avian Veterinarians. Philadelphia; 1995:349-350.
7. Mysore J., Read D., Daft B. Circovirus-like particles in finches (Abstract). Proceedings of the Annual Conference of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Histopathology Section. Reno; 1995.
8. Twentyman C. M., Alley M. R., Meers J., Cooke M. M., Duignan P. J. Circovirus-like infection in a southern black-backedgull (Larus dominicanus). Avian Pathol 1999;28:513-316.
9. Eisenberg S. W. F., Vanesten A. J. A. N., Vanederen A. M., Dorrestein E. M. Detection of circovirus with a polymerase chain reaction in the ostrich (Struthio camelus) on a farm in the Netherlands. Vet Microbiol 2003;95:27-38.
10. Sanada Y., Sanada N., Kubo M. Electron microscopical observations of psittacinebeak and feather disease in an umbrella cockatoo (Cacatua alba). J Vet Med Sci 1999;61:1063-1065.
11. Coombes A. L., Crawford G. R. Chicken anaemia virus: a short review. World’s Poultry Science Journal 1996;52:267-277.
12. Lowenstine L. J. Cockatoo feather disease: A summary of preliminary findings. Proc 3rdWest Poul Dis Conf Davis, 1984:94-96.
13. Latimer K. S., Rakich P. M., Kircher I. M., Ritchie B. W., Niagro F. D., Steffens W. L., Lukert P. D. Extracutaneus viral inclusions in psittacine beak and feather disease. J Vet Diagn Invest 1990;2:204-207.
14. Wylie S. L., Pass D. A. Experimental reproduction of psitacine beak and feather disease/french moult. Avian Pathol 1987;16:269-281.
15. Ritchie B. V., Niagro F. D., Lukert P. D., Steffens W. L., Latimer K. S. Characterization of a new virus from cockatoos with psittacine beak and feather disease. Virology 1989a;171:83-88.
16. Latimer K. S., Rakich P. R., Steffens W. L., Kircher I. M., Ritchie B. V., Niagro F. D., Lukert P. D. A novel DNA virus associated with feather inclusions in psittacine beak and feather disease.Vet Pathol 1991;28:300-304.
17. Riddoch P. A., Raidal S. R., Cross G. M. Psittacine circovirus antibodydetection and an update on the methods for diagnosis of psittacine beak and feather disease. Aust Vet Practit 1996;26:134-139.
18. Kiatipatanasakul-Banlunara W., Tantileartcharoen R., Katayama K., Suzuki K., Lekdumrogsak T., Nakayama H., Doi K. Psittacine beak and feather disease in three captive sulphur-crested cockatoos (Cacatua galerita) in Thailand. J Vet Med Sci 2002;64:527-529.
19. Grymová V. Poruchy opeření exotických ptáků.Veterinářství 1996;46:454-460.
20. Grymová V. Druhová predispozice kakaduů k onemocněním. Veterinářství 2000;50:522.
21. Ritchie B. W., Niagro F. D., Lukert P. D., Latimer K. S., Steffens W. L., Pritchard N. A review of psittacine beak and feather disease. J Assoc Avian Vet 1989;3:143-149.

Práce byla financována z projektu MZE – M03 – 99 – 01.

Adresa autora:
MVDr. Bedřich Šmíd, DrSc.,
Výzkumný ústav veterinárního lékařství,
Hudcova 70,
621 32 Brno
e-mail: smid @vri.cz

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *