Hemolytické anémie a jejich průkaz Coombsovým testem

M. FALDYNA1,2, H. KUDLÁČKOVÁ1, P. KNÖTIGOVÁ1, M. TOMAN, CSC.1,2 1 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno 2 Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Veterinářství 2006;56:533-536.

SOUHRN
Faldyna, M., Kudláčková, H., Knötigová, P., Toman, M. Imunitně zprostředkované hemolytické anémie a jejich průkaz Coombsovým testem.
Cílem sdělení je připomenout jednu z častých příčin sníženého počtu erytrocytů, imunitně zprostředkovanou hemolytickou anémii a ukázat její postavení v rámci ostatních anémií. Jsou zde také naznačeny možnosti její laboratorní diagnostiky se zaměřením na Coombsův test a prezentovány výsledky a zkušenosti s tímto testem.

SUMMARY
Faldyna, M., Kudláčková, H., Knötigová, P., Toman, M. Immune-mediated heamatolytic anaemia and its detection with Coombs´ test.
The aim of this paper is to notify one of the common causes of decreased number of erythrocytes, immune-mediated heamolytic anaemia and demonstrate its position in the frame of other anemias. There also are implied possibilities of its laboratory diagnostics with a view to the Coombs´ test as well as presented results and knowledge with this test.

Úvod
Anémie je definována jako snížení množství erytrocytů, hemoglobinu a hematokritu v krvi pod hodnotu obvyklou u konkrétního živočišného druhu s přihlédnutím k věku zvířete.1,2
Klinické příznaky anémie souvisí s poruchou prokrvení tkání a jejich nedostatečným zásobováním kyslíkem. Intenzita těchto příznaků závisí nejen na stupni anémie – hodnoty hemoglobinu, ale i na rychlosti vzniku anémie. Vzniká-li chudokrevnost pomalu, mohou se v organismu uplatnit kompenzační mechanismy, které umožní adaptovat se na nižší hodnoty hemoglobinu.3 Ke kompenzačním mechanismům patří:
– posun disociační křivky hemoglobinu pro kyslík, doprava díky zvýšené hladině 2,3 difosfoglycerátu v erytrocytech, jedná se o bezprostřední odpověď na tkáňovou hypoxii
– přesun krve z tkání, které jsou méně citlivé na nedostatek kyslíku (kůže, ledviny)
– zvýšený minutový výdej (tepový objem x srdeční frekvence), který je částečně umožněn snížením viskozity krve při chudokrevnosti
– zvýšení erytropoézy díky zvýšené produkci erytropoetinu, za předpokladu, že kostní dřeň je funkční.
Obecnými klinickými příznaky anémií jsou únava, slabost, dušnost, palpitace, závratě, bledost sliznic, kůže, žloutenka, splenomegalie a otoky. Anémie se podle morfologie erytrocytů rozdělují na mikrocytární, normocytární a makrocytární. Podle množství hemoglobinu v erytrocytech se rozdělují anémie na hypochromní a normochromní. Zvýšená krvetvorba je spojena s uvolňováním většího množství nezralých forem erytrocytů – retikulocytů – do krve. Retikulocyt je bezjaderná polychromatická buňka červené krevní řady, která vzniká v kostní dřeni ze stádia oxyfilního normoblastu po vyloučení jádra. Vzniklý retikulocyt za normálních okolností setrvává dva až tři dny v kostní dřeni, pak se dostává do periferní krve. Retikulocyt obsahuje ribosomy, polyribosomy a mitochondrie. Tyto organely vytváří v cytoplasmě buňky retikulární síť a jsou tak zodpovědné za její polychromazii. Této vlastnosti se využívá při průkazu retikulocytů v periferní krvi, kdy po obarvení vzorku krve supravitálním barvením, např. 1% brilantkrezylovou modří, můžeme zjistit procento retikulocytů mezi erytrocyty (vyhodnocuje se 1000 erytrocytů).4

Určité množství retikulocytů se v periferní krvi nachází i za normálních okolností. Podle našich zkušeností je množství retikulocytů u novorozených štěňat do 7 %, dále pak počet retikulocytů klesá do 16 měsíců věku zvířete, kdy se ustálí na hodnotě dospělých psů, t.j. do 1,5 %. Zvýšená hemopoetická aktivita kostní dřeně při anemii je asociována se zvýšeným počtem retikulocytů v kostní dřeni, které se přibližně po třech dnech začnou ve vyšším počtu vyplavovat do periferní krve. Počet retikulocytů umožňuje rozdělit anémie na regenerativní a neregenerativní a je tedy významným parametrem usnadňujícím diferenciální diagnostiku příčin anémií.
Anémie se mohou vyvinout ze tří skupin příčin a jsou sumarizovány v učebnici Veterinární hematologie.1 První jsou ztráty krve nejčastěji krvácením. Je-li toto krvácení akutní, není spojeno s příznaky regenerativní anémie. Další skupinou je nedostatečná tvorba, např. jako důsledek nedostatku železa, vitamínu B12, B6, kyseliny listové, nebo jako důsledek nedostatečné funkce kostní dřeně. Také v tomto případě se jedná o neregenerativní typ anémie. Třetí skupinou příčin je nadměrný zánik erytrocytů jejich rozpadem – hemolýzou. Zánik erytrocytů může být vyvolán některými infekcemi (např. babesióza, anaplasmóza, hemobartonelóza aj.), poruchami některých enzymů, intoxikacemi chemickými látkami (měď, zinek, nitrity a nitráty) nebo jedy. Anémie z těchto příčin jsou většinou regenerativního charakteru.
Samostatnou kapitolou hemolytických anémií jsou imunitně-zprostředkované anémie (IMHA, immune-mediated haemolytic anaemia). V jejich patogenezi se uplatňuje hypersenzitivní reakce 2. typu, tedy cytotoxická reakce závislá na protilátkách. Tato reakce je zprostředkována vazbou protilátek a/nebo komplementu na určité struktury na povrchu erytrocytů. K rozpadu erytrocytů může dojít přímo v cévě (intravaskulární hemolýza) zejména po aktivaci kaskády komplementu. Uplatňují se zde zejména protilátky typu IgM nebo jsou erytrocyty ničeny extravaskulárně makrofágy ve slezině, případně játrech či kostní dřeni. Zde se uplatňují hlavně protilátky typu IgG. Pro tento mechanizmus jsou makrofágy vybaveny povrchovými receptory pro Fc-část molekuly IgG a receptory pro frakce komplementu. Místo rozpadu erytrocytů ovlivňuje rychlost nástupu a intenzitu klinických příznaků a také některých parametrů biochemických. U intravaskulární hemolýzy, která je u psa častější, je nástup klinických příznaků rychlejší a intenzivnější. Mimo obecné příznaky anémie se u IMHA s intravaskulární hemolýzou vyskytuje také zvýšené množství volného hemoglobinu, hemoglobinurie, ikterus a zvracení, alterace jaterních enzymů. Při extravaskulární hemolýze bývá častěji splenomegalie. V některých případech mohou být protilátky namířeny proti erytroidním prekurzorům v kostní dřeni. To vede k rozvoji těžké neregenerativní anémie (PRCA, pure red cell aplasia).5

IMHA může mít různé vyvolávající příčiny.6 Může se jednat o primární idiopatickou autoimunitní anémii (AIHA, autoimmune haemolytic anaemia), při níž vznikají protilátky proti normálním strukturám na povrchu erytrocytů a obvykle nelze nalézt vyvolávající příčinu. AIHA bývá doprovázená také poklesem počtu trombocytů. Pak se jedná o tzv. Evansův syndrom. Při sekundární IMHA vzniká imunitní reakce na antigeny, které se na povrchu erytrocytů normálně nevyskytují. Může se jednat o antigenní determinanty vzniklé z některých léků (penicilin, levamizol, trimetoprim), při některých infekcích (virus kočičí leukémie, hemobartonely, leishmania), při některých nádorových nebo autoimunitních onemocněních nebo jako důsledek transfúze krve. Mezi IMHA patří také samostatná nozologická jednotka – neonatální izoerytrolýza – což je hemolýza u mláďat způsobená příjmem kolostra s obsahem protilátek proti krevním skupinám. Existuje také onemocnění zvané nemoc chladových aglutininů. Tento syndrom je vyvolán přítomností IgM protilátek, které vyvolávají aglutinaci erytrocytů při teplotách nižších než 30° C. Proto dochází při poklesu teploty prostředí ke vzniku mikrotrombů a následně nekróz v apikálních částech těla.
IMHA je onemocnění vyskytující se u psa,7-10 kočky,11-12 koně13-16 a skotu.17 U psa je popisováno, že IMHA primární se vyskytuje častěji než sekundární a nejčastěji se vyskytuje u středně starých fen. Existuje také plemenná predispozice u kokršpanělů a pudlů, ale také u irských setrů a zlatých retrívrů, kteří patří k častěji postiženým plemenům.5
V laboratorních podmínkách se IMHA detekuje pomocí Coombsova testu, který je schopen odlišit imunitní příčinu anémie od ostatních. Jen výjimečně je popisována imunitně zprostředkovaná anémie s negativním Coombsovým testem.6 Tento test byl popsán v roce 1945.18 Je to metoda aglutinační, při které je pomocí Coombsova reagens, což je antisérum proti imunoglobulinům a komplementu, detekována přítomnost těchto molekul na povrchu erytrocytů. Coombsův test je pozitivní u primárních i sekundárních imunitně zprostředkovaných anémií.
V provedení existují dva postupy. Prvním je tzv. přímý Coombsův test (DAT, direct antiglobulin test). Při něm jsou vyšetřovány přímo erytrocyty pacienta. Je proto potřeba získat pacientovu nesrážlivou krev. Doporučovaným protisrážlivým přípravkem je EDTA. Dalším doporučením je neodkladný transport vzorku do diagnostické laboratoře. Důvodem je možné pokračování lýzy erytrocytů, zejména v případě aktivace komplementové kaskády. Erytrocyty jsou několikrát promyty pufrovaným roztokem NaCl, naneseny do mikrotitrační destičky a inkubovány s několika ředěními Coombsova antiséra. V případě, že na vyšetřovaných erytrocytech jsou přítomny protilátky a/nebo komplement, dojde k aglutinaci. Ta je zřejmá buď přímo při posouzení mikrotitrační destičky nebo při prohlížení buněčné suspenze v mikroskopu. Za pozitivní výsledek se považuje, když je zřejmá aglutinace při ředění antiséra 1 : 8 a vyšším.

Druhým postupem je nepřímý Coombsův test. Při něm se sérum pacienta nejprve inkubuje s erytrocyty zdravého dárce. Výhodou testu je možnost skladování vzorku zmrazeného séra. Jeho nevýhodou, které velmi výrazně snižuje vypovídací hodnotu testu, je fakt, že protilátky proti erytrocytům se volné v séru prakticky nevyskytují. Druhým negativním aspektem je, že zejména u sekundární IMHA se antigeny, proti kterým jsou protilátky namířeny, na erytrocytech dárce nevyskytují.5
Při diagnostice chladových aglutininů je třeba pamatovat, že odebraný vzorek je potřeba po celou dobu transportu do laboratoře skladovat při teplotě vyšší než 30 °C. Vlastní test je shodný s Coombsovým testem, jen se provádí současně při různých teplotách inkubace (37 °C, 30 °C, 20 °C a 4 °C). Pro diagnózu nemoci chladových aglutininů svědčí nález aglutinace při teplotě nižší než 30 °C.

Diskuse
Coombsův test je od roku 2003 součástí nabídky laboratorní diagnostiky oddělení imunologie Výzkumného ústavu veterinárního lékařství. Za tu dobu bylo přímou metodou vyšetřeno 83 vzorků psa s podezřením na IMHA. Výsledek 18 pacientů byl pozitivní. Z požadovaných devíti nepřímých testů nebyl pozitivní žádný. V souladu s udávanou predispozicí byl nejčastějším plemenem s pozitivním výsledkem kokršpaněl (4x) a rotvajler (3x), poměr samic a samců byl 10 : 8. Vzhledem k tomu, že nemáme k dispozici podrobné anamnestické a klinické údaje, nevíme, kolik vzorků bylo vyšetřováno, aniž k tomu byla jednoznačná indikace a nelze tedy z výsledků stanovit poměr imunitních a ostatních příčin hemolytických anémií. Pozitivní výsledek tohoto testu však výrazně podporuje imunitní charakter anémie u daného pacienta.

Závěr
Závěrem lze konstatovat, že anémie patří mezi nejčastější onemocnění krve ve veterinární medicíně a odlišení jejich různých příčin je nezbytné pro zahájení vhodné terapie. Při zvažování diferenciální diagnostiky hemolytické anémie je, kromě dalších klinických a laboratorních nálezů, provedení Coombsova testu jedním z laboratorních přístupů.

Práce byla podporována projektem Ministerstva zemědělství České republiky (MZE 0002716201).

Literatura:
1. Doubek J., Bouda J., Doubek M., Vodička R. Onemocnění krve a krvetvorných tkání savců. In: Doubek J. Veterinární hematologie. Brno; Noviko, 2003:177-315.
2. Jain N. C. Evaluation of anemias and polycythemias. In: Jain N. C. Essentials of veterinary hematology. Philadelphia; Lea&Febiger, 1993:159-168.
3. Buliková A. Erytrocyty a jejich poruchy. In: Lexová S. Hematologie pro zdravotní laboranty. Brno; Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 2000:27-82.
4. Doubek J., Bouda J., Fürll M., Scheer P. Laboratorní hematologie savců. In: Doubek J. Veterinární hematologie. Brno; Noviko, 2003:91-176.
5. Day M. J. Immune-mediated haematological disease. In: Day M. J. Clinical Immunology of the Dog and Cat. London; Manson Publishing, 1999:69-87.
6. Barta O. Tests detecting autoimmune diseases. In: Barta O. Monographs in Animal Immunology, vol.2: Veterinary Clinical Immunology Laboratory. Blacksburg; Bar-Lab, 1993:D0/1-D4/9.
7. Avolt M. D., Lund J. E., Pickett J. C. Autoimmune hemolytic anemia in a dog. Am Vet Med Assoc 1973;162:45-46.
8. Greene G., Kristensen F., Hoff E. J., Wiggins M. D. Cold hemagglutinin disease in a dog. J Am Vet Med Assoc 1977;170:505-510.
9. Klag A., Giger U., Shofer F. S. Idiopathic immune-mediated hemolytic anemia in dogs: 42 cases (1986-1990). J Am Vet Med Assoc 1993;202:783-788.
10. Day M. J. Serial monitoring of clinical, haematological and immunological parameters in canine autoimmune haemolytic anaemia. J Small Anim Prac 1996;37:523-534.
11. Scott D. W., Schultz R. D., Post J. E., Bolton G. R., Baldwin C. A. Autoimmune hemolytic anemia in the cat. J Amer Anim Hosp Assoc 1973;9:530-539.
12. Person J. M., Sicard M., Pellerin J. L. Autoimmune haemolytic anaemia in the cat: clinical and immunopathlogical study of five cases. Rev Méd Vét 1997;148:107-114.
13. Farrelly B. T., Collins J. D., Collins S. M. Autoimmune hemolytic anemia (AHA) in the horse. Irish Vet J 1966;20:42-46.
14. Moriarty K. M., Brown M. F., Sutton R. H. An anaemic state in a horse associated with a cold acting antibody. N Z Vet J 1976;24:85-92.
15. Mair T. S., Taylor F. G. R., Hillyer M. H. Autoimmune haemolytic anaemia in eight horses. Vet Rec 1990;126:51-53.
16. McConnico R. S., Roberts M. C., Tompkins M. Penicillin-induced immune mediated hemolytic anemia in a horse. J Am Vet Med Assoc 1992;201:1402-1403.
17. Fenger C. K., Hoffsis G. F., Kociba G. J. Idiopathic immune-mediated hemolytic anemia in a calf. J Am Vet Med Assoc 1992;201:97-99.
18. Coombs R. R. A., Mourant A. E., Race R. R. A new test for the detection of weak and „incomplete“ Rh agglutinins. Brit J Exp Pathol 1945;26:255-262. In: Barta O. Monographs in Animal Immunology, vol. 2: Veterinary Clinical Immunology Laboratory. Blacksburg; Bar-Lab, 1993:D0/1-D4/9.

Adresa autora:
MVDr. Martin Faldyna, Ph.D.
Výzkumný ústav veterinárního lékařství
Hudcova 70
621 00 Brno
email: faldyna@vri.cz

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *