Prevalence sérotypů a rezistence k antibiotikům u izolátů Haemophilus parasuis v České republice

NEDBALCOVÁ K., JAGLIČ Z., ONDRIÁŠOVÁ R., KUČEROVÁ Z. Výzkumný ústav veterinárního lékařství Brno Veterinářství 2005;55:763-768.

SOUHRN
Celkem 94 izolátů Haemophilus parasuis pocházejících z 52 chovů prasat v České republice bylo sérologicky typizováno koaglutinačním testem. Největší prevalence byla zjištěna u sérotypu 4 (33 %), následovaly sérotypy 5 (29,8 %), 13 (7,4%) a 1 (5,3 %). Sérologicky netypizovatelných bylo 14,9 % izolátů. Sérotypy 2, 10, 12 a 14 byly izolovány ojediněle. Ostatní sérotypy (3, 6, 7, 8, 9, 11 a 15) nebyly diagnostikovány. Diskovou difúzní metodou byl stanoven různý podíl rezistentních izolátů k vybraným antibiotikům: erytromycin 84,4 %, streptomycin 78,1 %, sulfasomidin 68,8 %, ko-trimoxazol 57,8 %, tetracyklin, doxycyklin a kyselina nalidixinová shodně 21,9 %, amoxicilin 14,1 %, amoxicilin potencovaný kyselinou klavulanovou 12,5 % a norfloxacin 6,3 %. K cefalotinu nebyl rezistentní žádný izolát. U jednoho izolátu byla zjištěna multirezistence. Mezi rezistencemi k antibiotikům a sérotypem H. parasuis nebyla prokázána žádná závislost.

SUMMARY
A total of 94 Haemophilus parasuis isolates from 52 pig herds in the Czech Republic were serotyped using coagglutination test. Serotype 4 was the most prevalent (33 %), followed by serotype 5 (29,8 %), serotype 13 (7,4 %) and serotype 1 (5,3 %), whereas 14,9 % of the isolates were nontypable. Serotypes 2, 10, 12 and 14 were isolated sporadically. Remaining serotypes (3, 6, 7, 8, 9, 11 a 15) were not diagnosed. Different percentages of resistant isolates to selected antibiotics were determined by disc diffusion method: erythromycin 84,4 %, streptomycin 78,1 %, sulfasomidine 68,8 %, cotrimoxazol 57,8 %, tetracycline, doxycycline and nalidixic acid identically 21,9 %, amoxicillin 14,1 %, amoxicillin-clavulanic acid 12,5 % and norfloxacin 6,3 %. None of the isolates was resistant to cephalotine. The multidrug resistance was determined in one of isolates. No relationship between resistance to specific antibiotics and serotypes of H. parasuis was observed.

Úvod
Infekce Haemophilus parasuis mohou být příčinou velkého ekonomického zatížení chovatelů z důvodů nákladné antibiotické léčby a úhynů zvířat v akutních formách onemocnění.1 V konvenčních chovech se H. parasuis převážně podílí na respiračním syndromu, ale může také vyvolat akutní septikémii nebo Glässerovu chorobu, systémové onemocnění, které je charakterizováno fibrinózní polyserositidou, polyartritidou a meningitidou.2
Infekce způsobené H. parasuis probíhají enzooticky a mohou být akutní nebo chronické, v závislosti na imunologické situaci v chovu. Pokud je H. parasuis zanesen do chovů s imunologicky naivními zvířaty, může způsobovat závažná akutní onemocnění a hlavní postiženou věkovou kategorií jsou časně odstavená selata, přibližně ve věku 4 – 6 týdnů.3
K prevenci infekcí H. parasuis u prasat je možno využít medikaci antibiotiky nebo vakcinaci. Se zvýšenou spotřebou antibiotik, která jsou ve velké míře využívána pro léčbu a prevenci bakteriálního respiračního syndromu se však pojí velké riziko vzniku rezistencí jednotlivých mikroorganismů k antibiotikům.3
V současné době jsou dostupné vakcíny, založené na určitých sérotypech H. parasuis. Proto je znalost o rozšíření sérotypů nezbytnou informací k vyhodnocení možných účinků vakcinace na základě křížové protekce některých sérotypů H. parasuis.4, 5, 6
Sérotypizační studie prokázaly, že mezi izoláty H. parasuis je značná antigenní heterogenita. Existenci sérotypů H. parasuis poprvé popsali Bakos a kol.7 Zavedli první klasifikační schéma, které umožnilo na základě precipitačního testu izoláty H. parasuis roztřídit na sérotypy A, B, C a D. Morozumi a Nicolet definovali sedm sérovarů (1 – 7),8 ke kterým Kielstein a kol. přiřadili dalších šest sérovarů (Jena 6 – Jena 12).9 Kielstein a Rapp-Gabrielson identifikovali pět dalších sérovarů (ND1 – ND5) a na základě imunodifúzního testu se specifickými králičími antiséry navrhli nové klasifikační schéma pro sérotypizaci H. parasuis, ve kterém zůstaly dříve definované sérotypy 1 – 7 a ostatní sérotypy (Jena a ND) byly po sloučení navzájem se překrývajících sérotypů označeny jako 8 – 15. Podle tohoto v současné době mezinárodně uznávaného klasifikačního schématu je tedy definováno 15 sérotypů H. parasuis (1 – 15). Velký počet izolátů H. parasuis však nadále zůstává sérologicky netypizovatelný.10
Příslušnost mikroorganismů k určitému sérotypu se obvykle považuje za jeden ze základních indikátorů virulence. Vysoce virulentní sérotypy 1, 5, 10, 12, 13 a 14 s vysokou morbiditou byly příčinou úhynů SPF prasat v průběhu čtyř dnů, středně virulentní sérotypy 2, 4 a 15 způsobily polyserositidy bez úhynů a avirulentní sérotypy (3, 6, 7, 8, 9 a 11) nevyvolaly žádné klinické příznaky.2,10 Sérotypizace izolátů z klinických případů prokázala, že sérotypy 2, 4, 5, 12, 13 a 14 byly izolovány v přibližně stejném počtu z respiračních a systémových onemocnění.11,12 Průzkum prevalence sérotypů v Severní Americe ukázal, že potenciálně patogenní izoláty ze systémových onemocnění byly sérotypy 1, 2, 4, 5, 12, 13, 14 nebo sérologicky netypizovatelné izoláty. V horních cestách dýchacích zdravých zvířat byl predominantní sérotyp 3 a netypizovatelné izoláty.13
K sérologické typizaci izolátů H. parasuis jsou využívány různé metody, především koaglutinační test, imunodifúzní test a nepřímá hemaglutinace. Při použití všech těchto metod však zůstává stále vysoké procento izolátů sérologicky netypizovatelných. Jejich existence potvrzuje buď to, že některé izoláty pravděpodobně nemají dostatečné množství sérotypově specifických antigenů nebo existují zatím neidentifikované nové sérotypy.
V naší práci jsme k sérologické typizaci izolátů H. parasuis zvolili koaglutinační test. U všech izolátů byly také stanoveny rezistence k vybraným antibiotikům.

Materiál a metody
Bakteriální izoláty: byly získány z patologických lézí uhynulých prasat z 52 chovů v České republice. Primokultivace H. parasuis z klinického materiálu byly prováděny na krevním agaru (HiMedia). Vzhledem k závislosti H. parasuis na růstovém faktoru V byl jako zdroj NAD (nikotinamid-adenindinukleotid) použit proužek kmene Staphylococcus aureus.
K dalším kultivacím byl využíván čokoládový agar nebo Haemophilus test medium base (HTM) obohacené HTM suplementem (OXOID). Kultivace probíhaly přes noc při 37 °C. U všech izolátů byla provedena druhově specifická PCR.
PCR: pro diagnostiku H. parasuis byla provedena podle metodiky, kterou vyvinuli Oliveira a kol.1 PCR byla prováděna ve 20 µl reakční směsi, obsahující 10 ng vzorku DNA, 0,3 µM obou primerů, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 0,24 mM každého nukleotidu a 0,5 U Taq DNA polymerázy. PCR byla prováděna ve 30 cyklech, skládajících se z denaturace 30 sekund při 94 °C, chlazení při 59 °C 30 sekund a extense při 72 °C po dobu 2 minut.
Použité primery: HPS-forward (5´GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT 3´) a
HPS-reverse (5´GGC TTC GTC ACC CTC TGT 3´).
Velikost amplifikačního produktu je 821 bp. PCR produkt byl nanesen na 1 % agarózový gel. Elektroforéza běžela pět minut při 200 V. Gely byly obarveny roztokem etidium bromidu a vizualizované ozářením UV světlem.
Sérologická typizace: izoláty H. parasuis byly sérologicky typizovány koaglutinačním testem. Byla použita upravená metodika, kterou popsali Mittal a kol.14 pro Actinobacillus pleuropneumoniae. K výrobě pozitivních sér na králících byly použity referenční kmeny všech 15 sérotypů H. parasuis, které poskytl K. R. Mittal (Fakulta veterinární medicíny, Univerzita Montreal, Kanada). Králíci byli imunizováni bakteriálními suspenzemi referenčních kmenů sérotypů H. parasuis upravenými na optickou denzitu odpovídající McFarlandovu standardu č. 9 (přibližně 2 – 4 x 109 CFU) a inaktivovány 0,3 % (v/v) formalínem. Výsledné antigeny byly uchovány při 4 °C. Tyto suspenze byly králíkům aplikovány ve vzrůstajících dávkách intravenózně ve 3 až 4 denních intervalech (2 dávky 0,5 ml, 2 dávky 1 ml, 2 dávky 2 ml, 1 dávka 3 ml). Následně byla připravena bakteriální suspenze z živé kultury, která byla po třech dnech králíkům aplikována intravenózně v dávce 3 ml. Deset dní po poslední intravenózní aplikaci byli králíci vykrveni kardiální punkcí v celkové anestezii thiopentalem. Získaná séra byla po odstředění uchovávána při – 18 °C. Ze sér byly vyrobeny koaglutinační reagencie.
Stanovení rezistence k antibiotikům: izoláty H. parasuis byly vyšetřeny diskovou difúzní metodou na rezistenci k antibiotikům podle metodiky NCCLS pro náročné mikroorganismy.15 Byly použity Petriho misky s Haemophillus test medium base (HTM) obohaceným HTM supplementem (OXOID) a Vitoxem (OXOID) dle návodu výrobce. Izoláty H. parasuis byly nejprve kultivovány přes noc při 37 ºC. Následující den byla kultura resuspendována v PBS tak, aby zákal odpovídal 0,5 Mc Farlandova standardu (1 – 4 x 108 CFU/ml). Inokulum bylo aplikováno na plotny přelivem. Po následné inkubaci ploten 20 – 24 hodin při 37 ºC byly odečteny inhibiční zóny jednotlivých antibiotik.
K vyšetření byly použity následující disky s antibiotiky: amoxicilin 25 μg, amoxicilin/klavulanová kyselina 30 μg, cefalotin 30 μg, doxycyklin 30 UI, erytromycin 15 μg, ko-trimoxazol 25 μg, kyselina nalidixinová 30 μg, norfloxacin 10 μg, streptomycin 10 μg, sulfasomidin 300 μg, tetracyklin 30 μg (HiMedia).

Výsledky
Celkem bylo sérologicky typizováno 94 izolátů H. parasuis získaných z 52 chovů v České republice. U všech izolátů byly stanoveny rezistence k antibiotikům. Izoláty pocházely především z plic, pohrudniční tekutiny a srdce. Před sérotypizací a stanovením rezistencí k antibiotikům byla u všech izolátů provedena druhově specifická PCR.
Na základě sérotypizace koaglutinací byla u bakteriálních izolátů H. parasuis zjištěna největší prevalence sérotypu 4, který byl diagnostikován u 31 izolátů (33 %). Druhým nejčastěji se vyskytujícím sérotypem byl sérotyp 5, který byl diagnostikován u 28 izolátů (29,8 %). Dalšími sérotypy vyskytujícími se na našem území, ale již s menší frekvencí jsou sérotyp 13, který byl izolován v sedmi případech (7,4 %) a sérotyp 1 s pěti izoláty (5,3 %). U dalších sérotypů se již jedná jen o sporadické záchyty. Sérotypy 2 a 10 – u obou tři izoláty (3,2 %); sérotyp 12 – dva izoláty (2,1 %); sérotyp 14 – jeden izolát (1 %). Ostatní sérotypy (3, 6, 7, 8, 9, 11 a 15) diagnostikovány nebyly. Čtrnáct izolátů bylo sérologicky netypizovatelných (14,9 %). Tyto izoláty buď nereagovaly s žádným koaglutinačním reagens nebo u nich vznikaly vícečetné křížové reakce, a proto je nebylo možné zařadit do určitého sérotypu. Všechny sérotypizované izoláty patřily mezi vysoce virulentní (48,9 %) a středně virulentní (36,2 %) sérotypy, celkem 85,1 %. Žádný z diagnostikovaných sérotypů nebyl zařazen mezi avirulentní sérotypy.
Stanovení rezistencí k jednotlivým antibiotikům u H. parasuis diskovou difúzní metodou potvrdilo, že téměř ke všem běžně používaným antibiotikům existuje určité procento rezistentních izolátů. Vyhodnocení rezistencí k jednotlivým antibiotikům shrnuje graf 2.
Nejvíce rezistentních izolátů bylo k erytromycinu (84,4 %), streptomycinu (78,1 %), sulfasomidimu (68,8 %) a ko-trimoxazolu (57,8 %). U tetracyklinu, doxycyklinu a kyseliny nalidixinové byl shodný podíl rezistentních izolátů (21,9 %), menší zastoupení rezistencí bylo k amoxicilinu (14,1 %), k amoxicilinu potencovanému kyselinou klavulanovou (12,5 %) a norfloxacinu (6,3 %). Žádný izolát nebyl rezistentní k cefalotinu. U jednoho izolátu byla zjištěna multirezistence ke všem vyšetřovaným antibiotikům s výjimkou cefalotinu. Mezi rezistencemi k antibiotikům a sérotypem H. parasuis nebyla zjištěna žádná závislost.

Diskuse
Jedním z nejefektivnějších způsobů prevence ztrát, způsobených H. parasuis je vakcinace. Pro sestavení účinných vakcinačních programů je nezbytná znalost prevalence sérotypů v dané oblasti. Bylo prokázáno, že vakcinace může zprostředkovat částečnou křížovou protekci mezi sérovary, ale stupeň této protekce je velmi variabilní.5,6
Prevalence sérovarů H. parasuis se mezi jednotlivými zeměmi liší. V České republice, stejně jako ve většině jiných zemí, byly nejčastěji izolovány sérotypy 4 a 5. Dalším sérotypem, který se na území České republiky vyskytuje poměrně často je sérotyp 13. Podobné rozšíření sérotypů H. parasuis je v Japonsku16, Německu10, USA11, Kanadě17 a Španělsku.18 Sérotypy 5 a 13 byly prevalentní mezi izoláty v Austráli12,19,20 a v Dánsku.21
Všechny sérologicky typizované izoláty v České republice patřily k sérotypům, které Kielstein a Rapp-Gabrielson10 zařadili mezi vysoce a středně virulentní. Žádný z diagnostikovaných sérotypů nebyl zařazen mezi avirulentní. Zbývající izoláty byly sérologicky netypizovatelné a jejich procento bylo ve srovnání s jinými studiemi velmi podobné. Všechny izoláty pocházely z patologicky změněných orgánů zvířat a náhodné izolace H. parasuis z horních cest dýchacích, kde může být tento mikroorganismus přítomen jako součást běžné mikroflóry, nebyly prováděny. U některých zvířat byly izolovány pouze z respiračního traktu i vysoce virulentní sérotypy 1, 5, 12 13 H. parasuis. Již dříve bylo publikováno, že různé sérotypy mohou být nalezeny ve stejném počtu v respiračním traktu i v jiných orgánech.11, 12 Oproti tomu Oliveira a kol.13 izolovali sérotypy 2, 5 a 13 pouze z případů systémových onemocnění. Bylo však prokázáno, že v rámci jednotlivých sérotypů mohou být genetické rozdíly, které mohou způsobovat rozdílnou virulenci u izolátů stejného sérotypu.13,19 Proto nemůže být příslušnost k určitému sérotypu považována za jediný a stabilní znak virulence. V současnosti je však o jiných možných faktorech virulence H. parasuis velmi málo poznatků. Navíc mohou v patogenezi H. parasuis hrát významnou roli i hostitelské faktory, které rozhodují, zda vznikne respirační onemocnění nebo septikémie.
Medikace by měla být prováděna na základě stanovení citlivosti izolátů k jednotlivým antibiotikům. Dosud bylo publikováno velmi málo studií, které se zabývají stanovením rezistencí izolátů H. parasuis k antibiotikům, a proto není možné objektivní srovnání našich výsledků s výsledky jiných výzkumů. Obecně jsou pro terapii a prevenci onemocnění H. parasuis doporučovány pro nízké procento rezistencí penicilíny, aminoglykosidy, linkosamidy, makrolidy, tetracykliny a potencované sulfonamidy. Poměrně vysoké procento rezistentních izolátů se uvádí ke klasickým sulfonamidům.22-24
V naší studii jsme však zjistili, že nejvíce izolátů bylo rezistentních k erytromycinu, zástupci makrolidů a vysoké procento rezistencí bylo také ke ko-trimoxazolu, potencovanému sulfonamidu.

Závěr
Závěrem lze konstatovat, že se v České republice nejčastěji vyskytují mezi izoláty H. parasuis podobně jako v jiných zemích středně patogenní sérotyp 4 a vysoce patogenní sérotypy 5 a 13. Poměrně vysoký je i výskyt sérologicky netypizovatelných kmenů. Stanovení sérotypu u izolátů H. parasuis je významné z epidemiologického hlediska a pro kontrolní programy, jejichž cílem je eradikace nebo prevence vzplanutí onemocnění virulentními sérotypy. Vzhledem k výskytu rezistentních izolátů k některým antibiotikům je v antibiotické terapii onemocnění zásadní znalost aktuálních antibiogramů u izolátů z jednotlivých chovů.

Rukopis byl vypracován v rámci projektu MZE 0002716201.

Literatura:
1. Oliveira S., Galina L., Pijoan C. Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 2001;13:495-501.
2. Amano H., Shibata M., Kajio N., Morozumi T. Pathologic observations of pigs intranasally inoculated with serovar 1, 4 and 5 of Haemophilus parasuis using immunoperoxidase method. Journal of Veterinary Medical Science 1994;56:639-644.
3. Nicolet J. Haemophilus parasuis. In: Diseases of swine. 7th Ed.; Iowa State University Press,1992:526-528.
4. Nielsen R. Pathogenicity and immunity studies of Haemophilus parasuis serovars. Acta Veterinaria Scandinavica 1993;34:193-198.
5. Rapp-Gabrielson V. J., Kucur G. J., Clark J. T., Stephen K. M. Haemophilus parasuis: immunity in swine after vaccination. Veterinary Medicine 1997;92:83-90.
6. Bak H., Riising H. J. Protection of vaccinated pigs against experimental infections with homologous and heterologous Haemophilus parasuis. Veterinary Research 2002;151:502-505.
7. Bakos K., Nilsson A., Thal E. Untersuchungen über Haemophilus suis. Nordic Veterinary Medicine 1952;4:241-255.
8. Morozumi T., Nicolet J. Some antigenic properties of Haemophilus parasuis and a proposal for serological classification. Journal of Clinical Microbiology 1986;23:1022-1023.
9. Kielstein P., Rosner H., Müller W. Typing of heat stable soluble Haemophilus parasuis antigen by means of agargel precipitation and the dotblot procedure. Journal of Veterinary Medicine Series B – Infectious Diseases and Veterinary Public Health 1991;38:315-320.
10. Kielstein P., Rapp-Gabrielson V. J. Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis based immunodifusion using heatstable antigen extracts. Journal of Clinical Microbiology 1992;30:862-865.
11. Rapp-Gabrielson V. J., Gabrielson D. A. Prevalence of Haemophilus parasuis serovars among isolates from swine. American Journal of Veterinary Research 1992;53:951-956.
12. Blackall P. J., Rapp-Gabrielson V. J., Hampson D. J. Serological characterization of Haemophilus parasuis isolates from Australian pigs. Australian Veterinary Journal 1996;73:93-95.
13. Oliveira S., Blackall P. J., Pijoan C. Characterization of the diversity of Haemophilus parasuis field isolates by serotyping and genotyping. American Journal of Veterinary Research 2003;64:435-442.
14. Mittal K. R., Higgins R., Lariviere S. Identification and serotyping of Haemophilus pleuropneumoniae by coaglutination test. Journal of Clinical Microbiology 1983;18:1351-1353.
15. NCCLS Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals. Approved Standard – Second Edition. NCCLS document M31-A2. 2002:81.
16. Morikoshi T., Kobayashi K., Kamino T., Owaki S., Hayashi S., Hirano S. Characterization of Haemophilus parasuis isolated in Japan. Japanese Journal of Veterinary Science 1990;52:667-669.
17. Tadjine M., Mittal K. R., Bourdon S., Gottschalk M. Development of new serological test for serotyping Haemophilus parasuis isolates and determination of their prevalence in North America. Journal of Clinical Microbiology 2004;42:839-840.
18. Rubies X., Kielstein P., Costs L. I., Riera P., Artigas C., Espuna E. Prevalence of Haemophilus parasuis serovars isolated in Spain from 1993 to 1997. Veterinary Microbiology 1999;66:245-248.
19. Blackall P. J., Trott D. J., Rapp-Gabrielson V. J., Hampson D. J. Analysis of Haemophilus parasuis by multiloccus enzyme electrophoresis. Veterinary Microbiology 1997;56:125-134.
20. Rafiee M., Blackall P. J. Establishment, validation and use of the Kielstein-Rapp-Gabrielson serotyping scheme for Haemophilus parasuis. Australian Veterinary Journal 2000;78:846-849.
21. Angen Ø., Svensmark B., Mittal K. R. Serological characterization of Danish Haemophilus parasuis isolates. Veterinary Microbiology 2004;103:255-258.
22. Von Altrock A.: Occurrence of bacterial agents in lungs of pigs and evaluation of their resistance to antibiotics. Berliner und Münchener Tierarztliche Wochenschrift 1998;111:164-172.
23. De Rosa D. C., Veenhuizen M. F., Bade D. J., Shryock T. R. In vitro susceptibility of porcine respiratory pathogens to tilmicosin. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 2000;12:541-546.
24. Aarestrup F. M., Seyfarth A. M., Angen Ø. Antimicrobial susceptibility of Haemophilus parasuis and Histophilus somni from pigs and cattle in Denmark. Veterinary Microbiology 2004;101:143-146.

Adresa autora:
MVDr. Kateřina Nedbalcová
Výzkumný ústav veterinárního lékařství
Hudcova 70
621 00 Brno
e-mail: nedbalcova@vri.cz

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *