Problémy s izolací a identifikací termofilních Campylobacter sp.

I. STEINHAUSEROVÁ, K. FOJTÍKOVÁ, J. ČEŠKOVÁ Fakulta veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity Brno Veterinářství 2001;51:51-54

SOUHRN
Steinhauserová I, Fojtíková K, Češková J. Problémy s izolací a identifikací termofilních Campylobacter sp. Veterinářství 2001;51:51-54.
Špatný růst některých kmenů na selektivních médiích a nejasná biochemická diagnostika je pravděpodobně jedním z důvodů, proč záchyty některých druhů Campylobacter sp. (C. upsaliensis, C. lari) jsou na některých pracovištích velmi nízké nebo je prováděna nesprávná identifikace. Nejčastější problémy při druhové identifikaci bývají v konfirmaci C. jejuni a C. coli. Nejdůležitějším fenotypovým diskriminačním testem je schopnost hydrolýzy hipurátu, který je pozitivní pouze u C. jejuni. Některé kmeny C. jejuni však vykazují negativní hydrolýzu hipurátu a tím v podstatě znemožňují správnou identifikaci. Dalším významným problémem při druhové identifikaci termofilních Campylobacter sp. bylo zjištění značného výskytu nalidixic acid rezistentních kmenů i kmenů rezistentních k cephalotinu. Problémem je i variabilní schopnost tvorby sirovodíku C. coli na TSI agaru a slabá nebo negativní katalázová aktivita. Velkým přínosem pro správnou diagnostiku je zavedení molekulárních technik, které jsou při správném výběru metod schopny provádět rychlou a spolehlivou identifikaci. Pro účely diagnostiky byla ověřena metoda PCR–RFLP, která spolehlivě identifikovala druhy termofilních Campylobacter sp.

SUMMARY
Steinhauserová I, Fojtíková K, Češková J. Problems associated with isolation and identification of Campylobacter spp. Veterinářství 2001;51:51-54.
Poor growth in selective media and unclear biochemical identification rank with the causes of poor results in the isolation of some Campylobacter species (C. upsaliensis, C. lari) and erroneous identification. The most important phenotypic discrimination trait is hydrolysis of hippurate which unambiguously identifies C. jejuni, However, some strains of this species yiled negative results in this test. Further problems complicating the identification of thermophilic Campylobacter species include a high prevalence of nalidixic acid- and cephalotine-resistant strains, variability in the production of hydrogen sulphide by C. coli on TSI agar, and a low catalase activity, or absence thereof. A great step toward reliable identification has been the implementation of molecular techniques. Thermophilic Campylobacter species could be reliably identified by PCR-RFLP.

Každoročně se objevují zprávy o průkazu nových patogenních mikroorganismů pro člověka i pro zvířata. V naprosté většině se však nejedná o nové druhy, ale díky rozvoji poznání se u již popsaných druhů prokazují patogenní vlastnosti. Velký význam v epidemiologii infekčních onemocnění hrají i některé druhy Campylobacter sp. Rod Campylobacter zahrnuje řadu druhů, které mají rozdílné postavení z hlediska patogenity člověka. Nejčastější příčinou onemocnění člověka je C. jejuni, v menší míře pak C. coli. V posledních letech se pozornost věnuje i C. lari a C. upsaliensis, které jsou také považovány za humánní patogeny. Přenos Campylobacter sp. na člověka je ve většině případů způsoben konzumací kontaminované potraviny nebo vody. Možný přímý přenos představuje i nebezpečí chovu domácích zvířat, především psů a koček. Zvýšené nebezpečí onemocnění je především u dětí, které si s těmito domácími mazlíčky hrají a přicházejí do velmi úzkého kontaktu. K vyvolání onemocnění kampylobakteriózou u dětí stačí také velmi nízká infekční dávka.
C. lari (dříve C. laridis) patří do skupiny termofilních Campylobacter a byl poprvé identifikován v roce 1980 ze vzorků racků. C. lari bývá izolován především z vod a ze střevního obsahu ptáků, ale také z prasat, psů a jiných domácích i volně žijících zvířat. Výjimkou nejsou ani jeho nálezy v mořských živočiších, jako jsou nejrůznější mušle nebo ústřice, což může představovat nebezpečí onemocnění člověka při konzumaci těchto nedostatečně tepelně ošetřených produktů. U člověka C. lari způsobuje nejčastěji enteritidy, gastroenteritidy a především u osob s oslabeným imunitním systémem i celková onemocnění.
C. upsaliensis byl poprvé izolován a popsán teprve v nedávné době. V roce 1983 byla zjištěna přítomnost nového kataláza negativního Campylobacter sp. ve féces psů, kteří byli ošetřeni na veterinární klinice v Uppsale. Tento mikroorganismus byl původně zařazen do skupiny CNW (catalasa negative or weak positive strains). V roce 1985 byly poprvé popsány CNW organismy i v lidské stolici. Na základě homologních studií bylo zjištěno, že se jedná o nových druh, který byl pojmenován podle místa, kde byl poprvé popsán, jako C. upsaliensis V dalších letech byl C. upsaliensis stále častěji izolován od zvířat i z humánních vzorků a byl potvrzen jako humánní enteropatogen.1
C. upsaliensis je poměrně zřídka izolován z humánních klinických vzorků, a proto je jako humánní patogen relativně málo známý. Jedním z důvodů je i fakt, že běžně používaná selektivní média pro kultivaci termofilních kampylobakterů nejsou vhodná pro izolaci C. upsaliensis.
Naše pracoviště má dlouholeté zkušenosti s izolací a diagnostikou některých druhů rodu Campylobacter sp. V této práci bychom chtěli upozornit na některé problémy a úskalí při izolaci a identifikaci především termofilních druhů Campylobacter sp.

Materiál a metodika
Byly porovnávány výsledky fenotypové identifikace na základě biochemických a růstových vlastností kmenů a identifikace pomocí PCR-RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism). Pro práci byly použity kmeny izolované z rektálních výtěrů klinicky nemocných psů, koček a prasat a také kmeny Campylobacter sp. izolované od lidských pacientů trpících enteritidami.
Bakteriální kmeny: V práci byly použity kmeny Campylobacter sp., které byly izolovány z rektálních výtěrů psů a koček ošetřených na Klinice chorob malých zvířat VFU Brno a na soukromé veterinární klinice JAGGY. Z celkem vyšetřených 225 rektálních výtěrů bylo izolováno 51 kmenů Campylobacter sp.
Kmeny izolované od prasat pocházely ze selat do 6 týdnů věku, která trpěla enteritidami. Celkem bylo použito 63 izolovaných kmenů. Tyto vzorky byly získány ve spolupráci s Ústavem klinické mikrobiologie a imunologie VFU Brno.
Dále bylo vyšetřeno 90 suspektních kmenů Campylobacter sp., které byly izolovány z rektálních výtěrů od lidských pacientů s enteritidami. Z izolovaných kmenů, které byly získány ve spolupráci s firmou BioPlus, byly cíleně vybírány jen suspektní kmeny C. jejuni a C. coli. V naší laboratoři byly zpracovány už narostlé kultury.
Jako referenční kmeny byly použity kmeny C. jejuni CCM 6212, C. jejuni ATCC 33291, C. coli CCM 6211, C. lari CCUG 23947 a C. upsaliensis ATCC 43954.
Kultivace a biochemické testy: Po odběru byl každý vzorek tentýž nebo následující den naočkován přímo na plotnu se selektivním médiem CCDA (CM739, Oxoid) s přídavkem suplementu CAT (SR174, Oxoid) a současně se suplementem CCDA (SR155, Oxoid). Jako druhá pevná selektivní půda byl vybrán Karmali agar s příslušným suplementem (CM935, SR167 Oxoid). Naočkované misky byly inkubovány 48 h mikroaerofilně (5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2) při 37 °C nebo při 42 °C v případě použití Karmali agaru. Současně s přímou kultivací byl každý vzorek pomnožen v BHI bujónu (CM225) s přídavkem CAT suplementu (Oxoid). Po 48 hod při 37 °C v mikroaerofilním prostředí byl vzorek (0,1 ml) vyočkován na pevnou selektivní půdu CCDA s CAT suplementem a opět inkubován při 37 °C mikroaerofilně 2-4 dny. Mikroaerofilní prostředí bylo zabezpečeno použitím vyvíječů plynů Gas pack (BR 60, Oxoid). Suspektní kolonie byly přeneseny na Blood Agar Base No.2 (Oxoid) s přídavkem 7 % beraní krve a inkubovány za stejných podmínek 1-2 dny. Tyto bakteriální kmeny byly použity k druhové identifikaci.
Druhová identifikace byla prováděna pomocí následujících biochemických testů (dle ČSN ISO 10272): oxidázový test, test na přítomnost katalázy, indoxyl acetát, test na hydrolýzu hippurátu, citlivost na kyselinu nalidixovou a cephalotin, test na produkci sirovodíku na TSI médiu a byl hodnocen mikroaerofilní růst při teplotách 25, 30 a 37 °C.
Identifikace Campylobacter sp. pomocí PCR-RFLP: Bakteriální DNA byla extrahována upravenou metodou podle Maniatise.2 PCR byla prováděna s použitím primerů THERM1 a THERM43 specificky amplifikující polymorfní část genu pro 23S rRNA a následným restrikčním štěpení endonukleázami Alu I a Tsp509I. Tyto restrikční endonuklázy specificky štěpí C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis a C. lari a umožňují tak jejich druhové určení.

Výsledky
Kultivace vzorků: Odebrané vzorky byly kultivovány podle popsané metodiky a u suspektních kolonií po subkultivaci na Nutrient agar No. 2 s přídavkem 5% krve byly prováděny uvedené testy. Při použití CCDA s CAT suplementem nebo Karmali agaru některé kmeny C. upsaliensis nerostly vůbec nebo jen velmi špatně po více než 72 hodinové inkubaci. Mnohem lepší růst byl zaznamenán při kultivaci na krevním agaru. Při použití selektivního média pro kultivaci C. upsaliensis (CCDA médium s CAT suplementem) nebyla tato půda vždy vhodná pro průkaz C. upsaliensis. Například kontrolní referenční kmen ATCC 43954, který se běžně používá na řadě pracovišť, není schopen růstu na selektivní půdě CCDA s CAT suplementem ani na jiných použitých selektivních půdách.
Identifikace kmenů Campylobacter sp.: Z 51 vzorků Campylobacter sp. izolovaných ze psů a koček bylo biochemicky 27 určeno jako C. jejuni, 9 jako C. coli, 13 jako C. upsaliensis a 2 jako C. lari. Pokud byla provedena identifikace pomocí PCR a následného štěpení výše uvedenými enzymy bylo u hodnoceného souboru kmenů prokázáno 27 kmenů C. jejuni (shodně jako při biochemické identifikaci), ale pouze 2 kmeny C. coli. Zbývajících 7 kmenů biochemicky určených jako C. coli bylo na základě restrikčního štěpení identifikováno jako C. jejuni (6 kmenů) a C. upsaliensis (1 kmen). Identifikace C. upsaliensis byla shodná jak při fenotypové identifikaci tak i při restrikčním štěpení. Dva kmeny biochemicky určené jako C. lari však byly pomocí RFLP hodnoceny jako C. jejuni a C. upsaliensis.
Kmeny Campylobacter sp. izolované z prasat: Z celkem 63 kmenů izolovaných z prasat bylo biochemicky určeno jako C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis a C. lari v počtu 3, 40, 5, 15 (tab. II). Hodnocení na základě PCR-RFLP se početně neshodovalo ani u jednoho druhu Campylobacter. Z původních třech kmenů určených jako C. jejuni byl štěpením určen pouze jeden a ostatní dva jako C. coli. Z biochemicky určených C. coli (40) jich jako C. coli bylo PCR-RFLP potvrzeno 38 a dva kmeny byly hodnoceny jako C. jejuni. Biochemická identifikace C. upsaliensis (5 kmenů) a C. lari (15 kmenů) nebyla potvrzena ani v jednom případě. Naprostá většina kmenů byla molekulárními metodami určena jako C. coli (18) a dva jako C. jejuni.
Kmeny Campylobacter sp. izolované z lidského materiálu: Poněkud odlišná byla situace u humánních kmenů. Tyto kmeny byly izolovány již v komerční laboratoři pouze se skupinovým zaměřením na C. jejuni/coli a ostatní narostlé kmeny nebyly hodnoceny jako Campylobacter. Proto bylo na základě výsledků v naší laboratoři těchto 88 kmenů identifikováno biochemicky jako C. jejuni (62 kmenů) a C. coli (28 kmenů). Kmeny identifikované jako C. coli byly současně potvrzeny i restrikčním štěpením. Ze 62 kmenů biochemicky určených jako C. jejuni bylo PCR-RFLP hodnoceno jako C. jejuni pouze 58 kmenů a 4 byly určeny jako C. coli. Vzhledem ke způsobu primokultivace a vyhodnocování v komerční laboratoři nebyly zjištěny žádné další druhy Campylobacter sp. izolované ze vzorků stolice.

Diskuse
Mezi nejčastější problémy izolace některých druhů Campylobacter sp. je jejich snížená schopnost nebo až neschopnost růstu na univerzálních selektivních médiích doporučovaných pro izolaci Campylobacter sp. Hlavní příčinou je přídavek antibiotik jako selektivního činidla do izolačních půd. C. upsaliensis je citlivý ke kyselině nalidixové a ve většině případů i k cephalotinu, který se právě často přidává do selektivních půd pro izolaci termofilních druhů Campylobacter sp. Předpokládá se, že C. upsaliensis je méně inhibován cefoperazonem než cephalotinem. Proto bylo pro izolaci C. upsaliensis připraveno médium s CAT suplementem SR 174 obsahující cefoperazon (8 µg/ml), amphotericin (10 µg/ml) a teicoplanin (4 µg/ml), který se přidává do základu CCDA média. Senzitivita média závisí na MIC (minimální inhibiční koncentrace) jednotlivých kmenů k cefoperazonu, který je součástí selektivní půdy s CAT suplementem SR 174 v množství 8 µg/ml. Přitom někteří autoři4 uvádějí, že MIC cefoperazonu je
Špatný růst některých kmenů C. upsaliensis na selektivních médiích určených právě pro izolaci C. upsaliensis je uváděn i v literatuře. Přídavek antibiotik do izolačních půd způsoboval pomalejší růst, kdy se až po 72–96 hodinách objevoval skromný nárůst drobných kolonií a některé kmeny na selektivních agarech nerostly vůbec I jiní autoři5,6 uvádějí, že asi 8 % kmenů není schopno růst na selektivních médiích.
Také naše výsledky ukazují na nižší záchyt C. upsaliensis na těchto selektivních půdách. Například kontrolní referenční kmen ATCC 43954, který se běžně používá na řadě pracovišť, není schopen růstu na selektivní půdě CCDA s CAT suplementem.
Z těchto důvodů byly zavedeny nové izolační postupy na základě filtračních technik pomocí membránových filtrů nebo upravených selektivních půd s takovými antibiotiky, která neinhibují růst např. C. upsaliensis. Při rutinním zavedení těchto metod se významně zvýšil počet izolovaných méně obvyklých druhů identifikovaných především jako C. upsaliensis a ostatních CNW.7
Další problém spočívá ve správné identifikaci izolovaných druhů. Vzhledem k tomu, že příslušníci rodu Campylobacter mají jen slabou biochemickou aktivitu, je jejich správná diagnostika na základě fenotypových znaků dosti problematická.
Nejčastější problémy při druhové identifikaci bývají v konfirmaci C. jejuni a C. coli. Nejdůležitějším fenotypovým diskriminačním testem je schopnost hydrolýzy hipurátu, který je pozitivní pouze u C. jejuni. Některé kmeny C. jejuni však neštěpí hipurát a tím v podstatě znemožňují správnou identifikaci. Schopnost hydrolýzy hipurátu je vázána na hipurikázový gen hip O, který nevykazuje výrazný polymorfismus, což představuje dobrou možnost pro konfirmaci kmenů C. jejuni.8 Existují však atypické kmeny C. jejuni, které díky substituci nebo deleci páru bazí ve vybraném primeru nedávají očekávaný PCR produkt.3 Při sledování tohoto genu bylo prokázáno, že u některých kmenů C. jejuni po provedené PCR reakci byla zjištěna přítomnost genu hipurikázy, ale výsledný produkt byl asi o 300 bp kratší než předpokládaný výsledek. Takové kmeny jsou celkem často popisovány v literatuře a mohou dávat negativní výsledky při biochemickém hodnocení.9 I v námi sledovaném souboru bylo zjištěno 8 kmenů, které byly biochemicky určeny jako C. coli a na základě restrikčního štěpení jako C. jejuni.
Dalším významným problémem při druhové identifikaci termofilních Campylobacter sp. bylo zjištění značného výskytu nalidixic acid rezistentních kmenů. Tyto kmeny byly izolovány především od prasat a biochemicky připomínaly C. lari, i když výskyt tohoto druhu je u prasat celkem ojedinělý. K mylné fenotypové identifikaci napovídala i variabilní schopnost tvorby sirovodíku C. coli na TSI agaru. Podobně je v literatuře popisována u 10–15 % rezistence C. upsaliensis k cephalotinu, což může vést k chybnému určení kmene jako C. coli. Také v této práci jsou uváděny kmeny izolované od prasat biochemicky určené jako C. upsaliensis, aby po následné PCR a restrikčním štěpení byly určeny jako C. coli.
Molekulární metody a především PCR významným způsobem posunuly vpřed bakteriální diagnostiku. Pro diagnostiku je používána celá řada druhově nebo i rodově specifických primerů. Specifita vybraných primerů není samozřejmě garantovaná absolutně. Při výskytu genových anomálií v použité sekvenci může být ovlivněna velikost výsledného PCR produktu, který mívá klíčový význam při posuzování výsledku reakce, nebo může být PCR reakce falešně negativní, protože se výsledný úsek vůbec neamplifikuje. Přesto molekulární metody hrají v současné době rozhodující význam při identifikace a typizaci celé řady mikroorganismů, virů i parazitů. Jejich předností je, že se může současně využívat více metod, a tím se slabé místo jedné metody kompenzuje metodou jinou. V běžné praxi a diagnostice však mají klasické fenotypové metody své nezastupitelné místo a jedná se jen o to zvolit správné kombinace metod fenotypových a molekulárních k dosažení optimálního výsledku.

Literatura:
1. Bourke B, Chan VL, Sherman P. Campylobacter upsaliensis: Waiting in the Wings. Clin Microbiol Rew 1998;11:440-449.
2. Maniatis T, Frirsch EF, Sambrook J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor. New York;Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:580.
3. Fermér CH., Engvall EO. Specific PCR Identification and Differentiation of the Thermophilic Campylobacters, Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, and C. upsaliensis. J Clin Microbiol 1999;37:3370-3373.
4. Lawson AJ, Linton D, Stanley J, Owen RJ. Polymerase chain reaction detecton and speciation of Campylobacter upsaliensis and C. helveticus in human faeces and comparison with culture techniques. J Appl Microbiol 1997;83:375-380.
5. Burnens AP, Angéloz-Wick B, Nicolet J. Comparison of Campylobacter carriage rates in diarrheic and healthy pet animals. J Vet Med B 1992;39:175-190.
6. Hald B, Madsen M. Healthy puppies and kittens as carriers of Campylobacter spp., with special reference to Campylobacter upsaliensis. J Clin Microbiol 1997;35:3351-3352.
7. Goossen H, Pot B, Vlaes L, et al. Characterization and description of Campylobacter upsaliensis isolated from human feces. Lancet 1990;335:584-586.
8. On SLW. Identification Methods for Campylobacters, Helicobacters, and Related Organisms. Clin Microbiol Rev 1996;405-422.
9. Linton DA, Lawson J, Owen RJ and Stanley J. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J Clin Microbiol 1997;35:2568-2572

Adresa autora:
Doc. MVDr. Iva Steinhauserová, CSc.
Ústav hygieny a technologie masa VFU Brno
Palackého 1-3
612 42 Brno
E-mail: steinhauserovai@vfu.cz

Kompletní text včetně obrazového materiálu naleznete ve Veterinářství 2001;51:51-54.

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *