J. HORNÍČKOVÁ, H. MIKULCOVÁ, L. ČERNÍKOVÁ, V. VOŠTIŇÁKOVÁ,
Z. PIRCHANOVÁ, A. NAGY
Státní veterinární ústav Praha
Veterinářství 2010;60:207-210.
SOUHRN
Horníčková J., Mikulcová H., Černíková L., Voštiňáková V., Pirchanová Z., Nagy A. Výskyt nízce patogenní aviární influenzy subtypu H7N9 v komerčním chovu husy domácí v České republice v roce 2009.
Riziko zavlečení viru aviární influenzy, především do chovů drůbeže, je neustále velmi aktuální. Závažnost onemocnění závisí jednak na vnímavosti jednotlivých druhů ptáků, ale především na patogenitě virového kmene. Za nebezpečné se považují především subtypy H5
a H7. Do roku 2009 se v České republice vyskytoval pouze subtyp H5. V únoru 2009 byl
v komerčním chovu husy domácí identifikován virus nízce patogenní aviární influenzy (LPAI) subtypu H7N9. Popsané ohnisko představuje první nález LPAI H7N9 viru v komerčním chovu drůbeže v oblasti Euroasie a zároveň první záchyt viru aviární influenzy subtypu H7, který byl nalezen v České republice (ČR). Cílem naší studie bylo objasnění vztahu viru H7N9, který byl detekován v ČR, k dalším euroasijským virům aviární influenzy subtypu H7.
SUMMARY
Horníčková J., Mikulcová H., Černíková L., Voštiňáková V., Pirchanová Z., Nagy A. Occurrence of low pathogenic avian influenza subtype H7N9 in the commercial breed of
domestic goose in the Czech Republic in 2009.
Risk of importation of avian influenza virus, especially to poultry breeds, has constantly been very topical. Relevance of this disease depends partly on perception of individual species of birds, but mainly on pathogenicity of virus strain. Subtypes of H5 and H7 are of high emergency. Until 2009, only subtype H5 occurred in the Czech Republic. Virus of low pathogenic avian influenza (LPAI) subtype H7N9 has been identified in commercial breed of domestic goose in February 2009. Described focus presents the first finding of LPAI H7N9 virus in commercial poultry breeds in Eurasian region and same the first detection of avian influenza virus, subtype H7 in the Czech Republic. The objective of this presented study was to elucidate relationship of H7N9 virus that was confirmed in this country to other Eurasian viruses of avian influenza subtype H7.
Úvod
Vodní ptáci z řádů vrubozobí (Anseriformes) a dlouhokřídlí (Charadriiformes) představují hlavní rezervoár viru aviární influenzy (AI) v přírodě. Obecně platí, že všechny subtypy viru AI, které se vyskytují u volně žijících ptáků, jsou nízce patogenní (LPAI - low pathogenic avian influenza) a způsobují mírné nebo žádné klinické příznaky. Proto infikovaní ptáci mohou vylučovat a přenášet virus na velké vzdálenosti během migrace, a tím infikovat jiné volně žijící ptáky nebo přenášet virus do komerčních chovů drůbeže.1,2
Viry influenzy typu A jsou obalené RNA viry ze segmentovaným genomem, který se skládá z 8 jednovláknových segmentů RNA negativní polarity. Taxonomicky jsou zařazeny do čeledi Ortomyxoviridae, kde jsou viry typu A dále klasifikovány do subtypů na základě kombinace dvou hlavních povrchových antigenů – hemaglutininu (HA) a neuraminidázy (NA). V současnosti je známo 16 HA (H1 – H16) a 9 NA (N1 – N9) subtypů, což teoreticky umožňuje generovat 144 různých subtypových kombinací, ale do dnešní doby bylo identifikováno pouze 102.3
V porovnání s heterogenitou výskytu chřipkových virů u divoce žijícího ptactva byly doposud u domácí drůbeže identifikovány viry AI pouze s 13 HA subtypy (H1 – H13).4 Subtypy H7 a H5 představují skryté nebezpečí, protože jejich schopnost zmutovat během cirkulace u domácí drůbeže z LPAI na HPAI (highly pathogenic avian influenza)5,6 může vést až ke 100% mortalitě v chovu.7 Monitorovací studie prováděné na území Evropy naznačují, že LPAI formy subtypů H5 a H7 pravidelně cirkulují u vodního ptactva, a to nejčastěji
v H5N2, H5N3 a H7N1, H7N2, H7N3 a H7N7 subtypových kombinacích .3,8,9,10,11,12
Naopak monitoring viru AI u domácí drůbeže a volně žijících ptáků v ČR, prováděný v letech 2003 až 2008, neprokázal u domácí drůbeže a volně žijících ptáků v České republice žádný subtyp H7. V únoru 2009 byl virus detekován v chovu domácích hus v Jihomoravském kraji, v okrese Hodonín. V Národní referenční laboratoři pro aviární influenzu a newcastleskou chorobu (NRL pro AI a ND) Státního veterinárního ústavu v Praze byla provedena kompletní molekulárně–genetická a fylogenetická analýza kmenu H7N9. Úlohou prezentovaného příspěvku je poskytnout základní informace o historicky prvním záchytu LPAI subtypu H7 v České republice.
Materiál a metody
Identifikace a detekce viru
V rámci pravidelného monitoringu byla v chovu odebrána sada 20 kloakálních a 20 tracheálních výtěrů (147C Virus Transport-Single Swab, Copan Innovation, Itálie), která byla ve zchlazeném stavu dopravena do NRL pro AI a ND SVÚ Praha.
Identifikace viru byla provedena pomocí real–time RT–PCR pro univerzální detekci viru AI.19 Následně byly výsledky potvrzeny metodou doporučenou Community Reference Laboratory (CRL) ve Weybridge (Velká Británie). Subtyp HA byl určen H7 specifickou real–time RT–PCR metodou13 a NA pomocí RT–PCR metody dle Fereidouniové a kolektivu14 a potvrzen sekvenováním a BLAST analýzou. Aminokyselinový motiv štěpného místa byl určen sekvenační analýzou.13
Izolace viru
Pro izolaci viru na kuřecích embryích (KE) byl vybrán vzorek s nejvyšší pozitivitou. Byla připravena 10-20% suspenze vzorku v roztoku PBS s antibiotiky, ta se inkubovala při laboratorní teplotě 1-2 hodiny. Po centrifugaci (1000g) bylo 200 µl vyčeřené suspenze inokulováno do alantoidní tekutiny (AT) pěti 9–11 denních kuřecích embryí (KE) prostých specifických patogenů a protilátek. Kuřecí embrya byla inkubována v termostatu při teplotě 37°C a 2x denně kontrolována prosvěcováním v temné komoře. Úhyn byl pozorován u všech pěti KE čtvrtý den po inokulaci. Poté byla KE zchlazena na teplotu 4°C a byla z nich odebrána alantoidní tekutina.15 Virus byl prokázán v AT hemaglutinačním testem (HT) s drůbežími červenými krvinkami. Typizace H antigenu byla provedena s H7 pozitivním sérem hemaglutinačně inhibičním (HI) testem. Získaný kmen AI H7N9 byl v souladu s konvenční nomenklaturou pojmenován jako A/goose/Czech Republic/1848/2009 (H7N9) a v dalším textu se uvádí pod zkratkou CZE/H7N9.
Fylogenetická analýza
Fylogenetická analýza sekvencí byla provedena s využitím algoritmů Parsimony, Neighbour joining (NJ) a Maximum likelihood (ML) programu PHYLIP.21 Pro Parsimony a NJ byly kalkulace provedeny v 1000 a pro ML ve 100 replikacích.
Konfirmace výsledků
Paralelně s prováděnými analýzami byla alantoidní tekutina zaslaná ke konfirmaci do CRL ve Weybridge (Velká Británie).
Výsledky
Charakteristika ohniska
Ohnisko nízce patogenní aviární influenzy H7N9 vzniklo 3.února 2009 v okrese Hodonín, v lokalitě rybníků Písečenský, Lužický a Dvorský (obr 1). Chov sestával ze 3 hejn hus o celkovém počtu 2952 kusů a jednoho hejna kachen o velikosti 350 kusů. V chovu nebyly pozorovány žádné klinické příznaky. Pozitivní hejno pocházelo z rybníku Písečenský, kde se nacházelo 679 ptáků, bylo vyšetřeno 20 tracheálních a 20 kloakálních výtěrů. Z celkového počtu analyzovaných vzorků 5 tracheálních a 4 kloakální výtěry byly pozitivní na AI subtyp H7N9.
Všech 679 ptáků bylo utraceno a byla přijata opatření v souladu s vyhláškou č. 36/2007 Sb. o opatřeních pro tlumení aviární influenzy. Kolem ohniska bylo vytvořeno pásmo s omezením o průměru 1 km, v blízkosti ohniska se nevyskytovala žádná komerční hospodářství drůbeže. Následoval opakovaný odběr ostatních ptáků z chovu, prováděný týdně během jednoho měsíce po depopulaci. Vzorky byly negativní sérologicky i virologicky.
Výsledky NRL pro AI a ND SVÚ Praha byly konfirmovány CRL ve Weybridge (Velká Británie) jako influenza A, subtyp H7N9 na základě HI a neuraminidázovo inhibičního (NI) testu. Patogenita byla potvrzena molekulární analýzou a testem IVPI (indexem intravenózní patogenity), kde hodnota indexu 0,15 ukázala na LPAI. Jen pro srovnání, vysoce patogenní kmeny mají index blížící se číslu 3. Všechny ptačí kmeny mající IVPI vyšší než 1,2 jsou HPAI.
Fylogenetická a molekulárně – genetická analýza
Fylogenetická analýza molekuly H7 provedená na základě reprezentativních euroasijských H7 AI virů naznačila, že kmen CZE/H7N9 je příbuzný, ale jasně odlišitelný od skupiny AI virů H7N3 detekovaných v Itálii v roce 2002–2004 a dále od dalších evropských H7NX virů z let 2005–2007 (obr.2).
Nejvyšší sekvenční homologie byla potvrzena s virem H7N9 detekovaným v roce 200820 u čírky obecné ve Španělsku, kmen A/Anas crecca/Spain/1460/2008 (H7N9), což je rok před objevením se viru AI subtypu H7N9 v České republice.
Sekvenování štěpného místa ukázalo sled aminokyselin PELPKGR/GLF. Tento motiv připomíná jednu z nejčastějších sekvencí štěpného místa PEIPKGR/G, což je typický motiv vyskytující se v mnoha amerických a euroasijských kmenech LPAI virů subtypu H7.
Molekulárně–genetická analýza jednotlivých virových proteinů naznačila přítomnost některých mutací popsaných u H5N1 subtypů v souvislosti s letalitou u kachen a zvýšené patogenity u kuřat.
Diskuse
Do roku 2002 byl výskyt subtypu H7N9 hlášen pouze ze Severní Ameriky, především z USA, kde byl detekován s nízkou frekvencí, avšak dlouhodobě u volně žijících ptáků, a během vypuknutí ohnisek v komerčních chovech drůbeže. Dostupné údaje týkající se amerických kmenů H7N9 byly omezeny na několik sekvencí IVR3 (USA: A/ruddy turnstone/DE/629/00 (H7N9), A/ruddy turnstone/DE/1538/2000 (H7N9), A/blue-winged teal/Ohio/566/2006 (H7N9); a Kanada A/mallard/ALB/114/1999 (H7N9)) nebo ohniska H7N9 u krůt a brojlerů v Minnesotě v roce 1988 kmen A/turkey/Minnesota/1/1988 (H7N9)16 a u hejna krůt v Nebrasce během června v roce 2007.17
Můžeme ale konstatovat, že od roku 2009 se rozšíření subtypu H7N9 v USA viditelně zvýšilo, přičemž v jednom roce byla hlášena tři LPAI ohniska: v březnu 2009 v Kentucky, v květnu 2009 v Tennessee a v červnu 2009 v Minnesotě.17,18
Kmen H7N9 byl poprvé v Evropě detekován v roce 2002 ve Švédsku A/mallard/ Sweden/91/02 (H7N9)10 a v roce 2008 v Mongolsku A/duck/Mongolia/119/2008 (H7N9), Španělsku A/Anas crecca/Spain/ 1460/2008 (H7N9)20 a v České republice (rok 2009). Zde popsané ohnisko představuje první nález LPAI H7N9 viru v komerčním chovu drůbeže v oblasti Euroasie a zároveň první AI virus subtypu H7, který byl nalezen v České republice.
Je obtížné odhalit původ kmene CZE/H7N9, pokud vycházíme jen z fylogenetické analýzy molekuly H7. Ve srovnání se souborem H7 sekvencí euroasijských virů AI je sekvence našeho izolátu CZE/H7N9 jasně odlišitelná od virů subtypu H7 HA, které se vyskytly v ohniscích u komerčních chovů drůbeže nebo byly nalezeny u volně žijících ptáků v Evropě 3,8,9,10,11,12 do roku 2007. Na základě fylogenetické analýzy molekuly H7 byl český kmen CZE/H7N9 nejvíce podobný s kmenem A/Anas crecca/Spain/1460/2008 (H7N9) detekovaným ve Španělsku v roce 2008. 20
Předpokládáme, že český H7N9 LPAI virus mohl vzniknout relativně nedávno díky mnohočetnému reassortmentu s účastí dalších AI virů jiných subtypů. Zda ohnisko LPAI viru H7N9 v ČR v roce 2009 představuje pouze náhodnou událost nebo je to známka zvyšující se prevalence subtypu H7N9 v Euroasii zůstává otázkou.
Závěr
Jak byl virus H7N9 zanesen do komerčního chovu husí? Proč nedošlo k rozšíření infekce na další hejna? Na základě obecně platného modelu o šíření viru AI je možné předpokládat, že původci infekce byly pravděpodobně divoké kachny, popřípadě jiné druhy vodního ptactva, které se vyskytovaly v daném čase na inkriminované lokalitě. Kromě toho nízká pozitivita analyzovaných vzorků, malá prevalence (9 pozitivních vzorků ze 40) a sérologická negativita naznačují, že k infekci mohlo dojít relativně nedávno před monitorovacím odběrem vzorků. Kombinace faktorů jako nízká virulence viru H7N9 a jeho detekce ve vzestupné fázi infekce spolu s opatřeními pro tlumení aviární influenzy pravděpodobně zabránily dalšímu šíření nákazy.
Literatura:
1. ,Webster, R.G., Bean, W.J., Gorman, O.T., Chambers, T.M., Kawaoka,Y. Evolution and ekology of influenza A viruses. Microbiol Rev 1992;56:152-179.
2. Olsen, B., Monster, V.J., Wallensten, A., Wallenstrom, J., Osterhaus, A. D. M. E., Fouchier, R. A. M. Global patterns of influenza A virus in wild birds. Science 2006;312:384-388.
3. Bao,Y., Bolotov, P., Dernovoy, D., Kiryutin, B., Zaslavsky, L., Tatusova, T., Ostell, J., Lipman, D. The Influenza Virus Ressource at the National Center for Biotechnology Information. J. Virol. 2008;82:596-601. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html.
4. Swayne, D. E. Avian influenza. Blackwell Publishing Ltd 2008.
5. Banks, J., Spiedel, E. S., McCauley, J. W., Alexander, D. J. Phylogenetic analysis of H7 haemagglutinin subtype influenza A viruses. Arch Virol 2000;145:1047-1058.
6. Banks, J., Spiedel, E. S., Moore, E., Plowright, L., Piccirillo, A., Capua, I., Cordioli, P., Fioretti, A., Alexander, D. J. Changes in the haemagglutinin and the neuraminidase genes prior to the emergence of highly pathogenic H7N1 avian influenza viruses in Italy. Arch Virol 2001;146:963-973.
7. Capua, I., Alexander, D. J. Avian influenza: recent developments. Avian Pathol 2004;33:393-404.
8. Campitelli, L., Di Martino, A., Spagnolo, D., Smith, G. J. D., Di Trani, L., Facchini, M., De Marco, M. A., Foni, E., Chiapponi, Ch., Martin, A.M., Chen, H., Guan, Y., Delogu, M., Donatelli, I. Molecular analysis of avian H7 influenza viruses circulating in Eurasia in 1999-2005: detection of multiple reassortant virus genotypes. J Gen Virol 2008;89:48-59.
9. Campitelli, L., Mogavero, E., De Marco, M. A., Delogu, M., Puzelli, S., Frezza, F., Facchini, M., Chiapponi, Ch., Foni, E., Cordioli, P., Webby, R., Barigazzi, G., Webster, R. G., Donatelli, I. Iterspecies transmission of an H7N3 influenza virus from wild birds to intensively reared domestic poultry in Italy. Virology 2004;323:24-36.
10. Munster, V. J., Wallensten, A., Baas, Ch., Rimmelzwaan, G. F., Schutten, M., Olsen, B., Osterhaus, A. D. M. E., Fouchier, R. A. M. Mallards and highly pathogenic avian influenza ancestral viruses, Northen Europe. EID 2005;11:1545-1551.
11. Munster, V. J., Baas, Ch., Lexmond, P., Wallenstrom, J., Wallensten, A., Fransson, T., Rimmelzwaan, G. F., Beyer, W. E. P., Schutten, M., Olsen, B., Osterhaus, A. D. M. E., Fouchier, R. A. M. Spatial, temporal and species variation in prevalence of influenza A viruses in wild migratory birds. PLOS Pathogenes 2007;3:630-638.
12. Terregino, C., De Nardi, R., Guberti, V., Scremin, M., Raffini, E., Martin, A. M., Cattoli, G., Bonifanti, L., Capua, I. Active surveillance for avian influenza viruses in wild birds and backyard flocks in Northern Italy during 2004 to 2006. Avian Pathol 2007;36:337-344.
13. Diagnostic Manual for Avian Influenza 2006. Official Journal of the European Union. Document number C (2006), 3477.
http://forums.flu-lab-net.eu/files/. http://www.defra.gov.uk/vla/science/sci_ai_reflab_prot.htm.
14. Fereidouni, S. R., Starick, E., Grund, C., Globig, A., Mettenleiter, T. C., Beer, M., Harder, T. Rapid
molecular subtyping by reverse transcription polymerase chain reaction of the neuraminidase gene of avian influenza A viruses. Vet. Microbiol. 2009;135:253-260.
15. OIE Manual of Diagnostic tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2009. Chapter 2.3.4.
16. Halvorson, D. A. Prevention and managment of avian influenza outbreaks: experiences from the United States of America. Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz. 2009;28:359-369.
17. WAHID,World Animal Health Information Database.http://www..oie.int/wahis/public.php?page=home
18. Reuters. Tennesse chicken flock found with mild bird flu. (May5, 2009)
http://www.reuters.com/article/rbssConsumerGoodAndRetailNews/idUSN0535178420090505
19. Nagy, A., Vostinakova, V., Prirchanova, Z., Černíkova, L., Dirbakova, Z., Mojzis, M., Jirincova, H., Havlickova, M., Dan, A., Ursu, K., Vilcek, S., Horníčkova. J. Development and evaluation of a one step real-time RT-PCR assay for universal detection of influenza A viruses from avian and mammal species. Arch Virol přijato k tisku.
20. Busquets, N., Alba, A., Napp, S., Sanchez, A., Serrano, E., Rivas, R., Nunez, J. I., Majo, N. Influenza A virus subtypes in wild birds in North–Eastern Spain (Catalonia). Virus Res doi:10.1016/j.virusres.2009.12.005.
21. Felsenstein, J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6. 2004; Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle.
http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html.
Adresa autora:
MVDr. Jitka Horníčková
Státní veterinární ústav
Síslištní 136/24
165 03 Praha 6-Lysolaje
