E. STANDAROVÁ, I. BORKOVCOVÁ, L. VORLOVÁ
Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Veterinářství 2008;58:735-739.
SOUHRN
Standarová E., Borkovcová I., Vorlová L. Obsah biogenních aminů v sýrech z české obchodní sítě.
Poznatky o obsahu biogenních aminů (BA) v potravinách jsou potřebné pro vyhodnocení možného rizika alimentární intoxikace při příjmu velkého množství potravin s vysokým obsahem BA. Cílem práce bylo vyhodnotit zastoupení a koncentrace BA v sýrech dostupných a konzumovaných v ČR. Bylo analyzováno 215 vzorků sýrů, pořízených v české obchodní síti v letech 2005 - 2007. BA v těchto sýrech byly po jejich extrakci ze vzorku stanoveny jako dansylderiváty metodou RP-HPLC s fluorescenční detekcí. Koncentrace sledovaných BA se pohybovaly v rozmezí jednotek až několika set mg/kg, nejvíce zastoupeny byly a nejvyšších koncentrací dosahovaly tyramin, putrescin a kadaverin, následovány histaminem. Nejvyšší celkové koncentrace BA byly stanoveny u měkkých zrajících sýrů a sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou, přičemž hodnoty BA dosáhly hodnot až 3 g na kg sýra.
SUMMARY
Standarová E., Borkovcová I., Vorlová L. Content of biogenic amines in cheeses from the Czech market.
The information on biogenic amines (BA) content in foods is important for evaluation of possible risk of alimentary intoxication at excessive intake of food with high concentration of these compounds. The aim of this work was to evaluate the distribution and concentration of BA in cheeses on the Czech market over the period of 2005 – 2007. BA levels were determined after extraction from cheese and derivatisation with dansylchloride using RP-HPLC method with fluorescence detection. Tyramine and putrescine were detected as the principal BA, followed by cadaverine and histamine. The highest content of BA (sum BA) was found in soft maturing cheese and Swiss-type hard cheese, where BA concentration reached as high a level as 3 g per 1 kg of cheese.
Úvod
Biogenní aminy (BA) jsou nízkomolekulární dusíkaté organické látky se značnou biologickou aktivitou, která se uplatňuje v metabolismu zvířat, rostlin a lidí.1 Jsou obsaženy ve fermentovaných potravinách, např. fermentovaných salámech, v sýrech, pivu, vínu a kysaném zelí.V potravinách připravených fermentační cestou jsou BA jejich pravidelnou a přirozenou součástí. U nefermentovaných potravin jsou BA především indikátorem nežádoucí mikrobiální činnosti. Stanovení BA může být využito k posouzení míry rozkladu sledovaného materiálu. V případě skladování potravin může být obsah BA ukazatelem jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny během výrobního procesu a skladování.2 Příjem potravin obsahujících vysoké koncentrace těchto sloučenin může u citlivých osob vyvolat alimentární intoxikaci. Histamin způsobuje vazodilataci cév a snížení krevního tlaku, je příčinou otravy z ryb (scombroid poisoning). Tyramin je příčinou migrén a hypertenzních krizí, tzv. reakce na sýr (cheese reaction), zejména u pacientů užívajících antidepresiva. Pro negativní vliv BA na lidské zdraví je žádoucí, aby se tyto aminy v potravinách vyskytovaly v minimálním množství.3
Normální příjem BA je metabolizován ve střevním traktu velmi výkonným detoxifikačním systémem založeným na aktivitě enzymů monoaminooxidázy (MAO), diaminoooxidázy (DAO) a histidinmethyltransferázy (HMT). Při nadměrném příjmu BA potravou však detoxikační kapacita tohoto systému nemusí stačit. Toxicita histaminu a tyraminu je zvyšována současnou konzumací alkoholu a potravin obsahujících jiné BA, zejména diaminy a polyaminy. Jejich negativní působení spočívá v odčerpání detoxikační kapacity enzymů MAO, DAO a HMT a v následném zesílení účinku toxičtějších BA.4 U skupiny polyaminů (sperminu, spermidinu) a diaminu kadaverinu byly však za určitých okolností pozorovány i jejich příznivé účinky jako je podpora regenerace a hojení tkání.5
Toxické dávky BA je obtížné stanovit. Velmi záleží na individuálních rozdílech mezi lidmi, zastoupení jednotlivých BA v potravině, množství konzumované potraviny a přítomnosti jiných potencujících složek, jakými jsou například alkohol nebo léky.6 Obsah histaminu 100 mg/kg vzorku může způsobit intoxikaci histaminem, 100 – 800 mg/kg tyraminu tzv. reakci na sýr (6 mg, pokud pacient užívá léky s účinkem MAO) a 30 mg/kg 2-fenylethylaminu migrénu.1 Spanier et al.7 navrhli, že suma histamin + tyramin + putrescin + kadaverin by pro sýr neměla překročit hodnotu 900 mg/kg. S tím souvisí i legislativní omezení nejvyšší přípustné dávky. Česká legislativa do roku 2004 obsahovala legislativní limity pro vybrané BA v rybách, sýrech, pivu a vínu, ale dnes je v ČR platný jen hygienický limit pro histamin v rybách a výrobcích z ryb uváděný v Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 ve výši 100. Tento limit může být ve dvou vzorcích z devíti z jedné šarže překročen až do hodnoty 200 mg/kg. Legislativa neurčuje výrobcům deklarovat obsah BA na obale.8
Vedle ryb jsou sýry nejčastěji uváděnou potravinou spojovanou s intoxikací BA. Sýry představují ideální prostředí pro tvorbu BA,9 které vznikají převážně dekarboxylací volných aminokyselin za působení bakteriálních dekarboxyláz. Dekarboxylázy aminokyselin se u bakterií příliš nevyskytují, ale schopnost tvořit BA byla popsána pro některé mikroorganismy zejména čeledi Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. a pro bakterie mléčného kvašení.2
Pro tvorbu BA je nutná přítomnost volných aminokyselin, bakterií obsahujících dekarboxylázy a podmínek, při nichž bakterie mohou růst a syntetizovat dekarboxylázy.10,11 Koncentrace volných aminokyselin v původní surovině i v sýru, jsou tak nízké, že působením dekarboxyláz by vzniklo netoxické množství BA. V nekontaminovaném mléce obsah BA nepřesahuje 1 mg/kg.12,6 Působením proteáz a peptidáz přítomných v sýru dochází k proteolýze kaseinu a tvorbě volných aminokyselin a následně BA, přičemž každý typ sýra má charakteristický profil aminokyselin a BA, který vyplývá ze specifické degradace a syntézy.13 Častější příčinou výskytu BA v sýrech je sekundární kontaminace mikroorganismů z přidávané startovací kultury.9 Sýry se srovnatelným mikrobiologickým profilem se mohou významně lišit v obsahu BA. Dokonce i různé kmeny jednoho druhu se mohou lišit v produkci BA až o několik řádů. Je proto obtížné najít přesné korelace mezi obsahy BA a počty mikroorganismů.2 Vzhledem k různorodosti druhů a kmenů jsou různé i optimální podmínky pro tvorbu BA jako je teplota, pH, přístup kyslíku nebo obsah soli.10
Sýry obvykle obsahují jednotky až stovky mg/kg histaminu, tyraminu, putrescinu a kadaverinu, jednotky až desítky mg/kg 2-fenylethylaminu a velmi malá množství tryptaminu.14 Obsahy BA však mohou výjimečně dosáhnout až gramových množství v 1 kg sýra, což závisí na ošetření výchozí suroviny a technologických faktorech, jako jsou teplota sýřeniny, použití startovacích a plísňových kultur.10 Výrazně vyšší množství BA bylo zjištěno u sýrů z nepasterovaného mléka.15
Studium obsahu BA v sýrech bylo námětem řady prací. Většina prací se však zabývá sledováním hladin nejvíce rozšířených BA v sýrech nebo jsou zaměřeny na určité druhy sýrů. Cílem předkládané studie proto bylo zaznamenat profil hygienicky významných BA v sýrech z běžné obchodní sítě, porovnat získané hodnoty s literárními údaji a odhadnout zdravotní rizika u jednotlivých typů sýrů pro zdravotně rizikové skupiny osob.
Materiál a metody
Vyšetřované vzorky
Analyzovány byly vzorky sýrů dostupných a konzumovaných v ČR, zakoupených v obchodní síti. Bylo vyšetřeno celkem 215 vzorků. Zastoupeny byly sýry s vysokodohřívanou sýřeninou (Ementál aj.), nízkodohřívanou sýřeninou (Eidam aj.), sýry s plísní na povrchu hmoty (Hermelín aj.), sýry s plísní uvnitř hmoty (Niva), měkké zrající sýry (Romadúr aj.), dále sýry smetanové a termizované (Lučina aj.), kozí sýry a tavené sýry.
Sledované analyty
Tryptamin, 2-fenylethylamin, putrescin, kadaverin, histamin, tyramin, spermidin a spermin.
Stanovení biogenních aminů
Příprava vzorku
Vzorky sýrů byly homogenizovány a BA byly extrahovány 10 % kyselinou trichloroctovou. BA v alikvotním podílu kyselého extraktu byly reakcí s dansylchloridem převedeny na jejich dansylderiváty, extrahovány do nepolárního rozpouštědla (petrolether, n-hexan) a po odpaření analyzovány metodou HPLC.
Podmínky HPLC stanovení
Analýzy byly prováděny na kapalinovém chromatografu Alliance 2695 (Waters, USA) s detektory PDA 2996 a fluorescenčním detektorem 2475. Detektory byly zapojeny v sérii. Byly použity chromatografické kolony s reverzní fází C 18 např. Polaris C 18 (Varian, USA), 150 mm x 4,6 mm, velikost částic 3 µm s předkolonkou Meta Guard Polaris C 18, 30 mm x 4,6 mm, 3 µm a Zorbax Eclipse XDB C18 (Agilent, USA), 150 x 4,6 mm, 5µm s předklonkou Zorbax 30 mm x 4,6 mm, 5 µm. Stanovení bylo prováděno v režimu gradientové eluce, mobilní fázi A tvořila směs 0,1 M kyseliny octové, acetonitrilu a methanolu (90:5:5), mobilní fázi B pak směs 0,1 M kyseliny octové, acetonitrilu a methanolu (10:45:45), průtok byl 1 ml.min-1, velikost nástřiku 10 μl. Detekce byla prováděna při λex/λem = 330/500 nm, detekce v UV oblasti při 254 nm. PDA detektor byl použit pro stanovení histaminu z důvodu jeho nízké odezvy na fluorescenčním detektoru. Každý vzorek byl analyzován minimálně ve dvou paralelních stanoveních, s každou sérií byl analyzován slepý vzorek. Vyhodnocení bylo provedeno metodou vnějšího standardu.
Výsledky a diskuse
V analyzovaných vzorcích byly nejvíce zastoupeny tyramin a putrescin, následovány kadaverinem a histaminem, kdežto hodnoty tryptaminu, fenylethylaminu, spermidinu a sperminu byly nízké. Obsah a profil BA v sýrech byl závislý zejména na typu sýra. Nejvyšší koncentrace BA byly nalezeny v sýrech s vysokodohřívanou sýřeninou a v měkkých zrajících sýrech, zatímco u sýrů smetanových (n=12) a termizovaných (n= 8) jednotlivé BA nebyly detekovány nebo byly obsaženy v malém množství. Z tohoto důvodu nebyly jejich hodnoty zahrnuty do tabulky (tab. 1).
Tab. 1
Histamin
Z měkkých sýrů byla nejvyšší koncentrace histaminu nalezena u pivního sýra (283 mg/kg). Tyto hodnoty jsou řádově vyšší než u měkkých sýrů ze zahraničí.16 U českých sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou byly hodnoty histaminu řádově nižší (u ementálu 151 mg/kg) než uváděné hodnoty v zahraničních sýrech stejného typu (ementál až 1500 mg/kg).12
Tyramin
Zjištěné hodnoty tyraminu dobře korelují s výsledky dřívějších studií.17 Nejvyšší koncentrace tyraminu byly nalezeny u sýrů z vysokodohřívanou sýřeninou (ementál 1123 mg/kg), měkkých zrajících sýrů (bryndza 417 mg/kg) a sýrů plísňových (Hermelín 187 mg/kg). U zahraničních sýrů téhož typu však bývají nalézány hodnoty i násobně vyšší (např. parmazán 2460 mg/kg).12
Putrescin
S výjimkou měkkých zrajících sýrů a sýrů plísňových byla koncentrace putrescinu u českých sýrů relativně nízká. Nejvyšší koncentrace byly nalezeny u brynzy (591 mg/kg) a tvarůžků (514 mg/kg). U měkkých zrajících sýrů nalezli Antila et al.16 obdobné hladiny putrescinu.
Kadaverin
Dřívější studie uvádějí, že sýry mohou obsahovat vysoké koncentrace kadaverinu, u sýra Camembert přesáhla hladina 1000 mg/kg.16 V českých sýrech obsahovala vysoké hladiny kadaverinu bryndza (1 110 mg/kg), tvarůžky (739 mg/kg) a Niva (699 mg/kg). U ostatních sýrů dosahovaly koncentrace kadaverinu nízkých až středních hodnot, u 8 % vzorků nebyl vůbec prokázán.
Tryptamin
Koncentrace tryptaminu byla u analyzovaných sýrů nízká nebo tryptamin nebyl vůbec detekován. Zahraniční prameny připouští i vysoké koncentrace (rocquefort až 600 mg/kg).17 U sýrů s vysokými koncentracemi tryptaminu byl prokázán i 2-fenylethylamin. Spanier et al.7 uvádějí toxickou hladinu tryptaminu 30 mg/kg. U 19 % námi analyzovaných vzorků byla zjištěna vyšší koncentrace.
Spermin, spermidin
Polyaminy (spermin a spermidin) byly ve sledovaných sýrech nalezeny v koncentracích odpovídajících jednotkám, výjimečně desítkám mg/kg. Nejvyšší koncentrace byly stanoveny u plísňových a měkkých zrajících sýrů, asi u 15 % vzorků však byly hodnoty pod mezí stanovitelnosti metody (
Celkové BA
V této studii byly nalezeny nejvyšší koncentrace celkových BA u tvarůžků (2 540 mg/kg), brynzy (2 490 mg/kg) a u ostatních měkkých zrajících sýrů. Vysoké koncentrace BA u tvarůžků (7 860 mg/kg) a u brynzy (1 967 mg/kg) uvádí i předešlé studie.18,19 Rovněž koncentrace celkových BA nalezené u Nivy (950 mg/kg) jsou v souladu s uváděnými údaji.20 Sýry s bílou plísní na povrchu nebo plísní uvnitř hmoty a sýry s vysokodohřívanou sýřeninou měly velmi odlišný obsah BA u různých výrobců. Vliv produkce (šarže) na obsah BA prokázali obdobně u sýra eidam i Komprda et al.21 Nejnižší koncentrace byly nalezeny u smetanových a termizovaných sýrů. U měkkých termizovaných sýrů je obsah BA spojen s technologickým postupem, kdy se výrobky s nízkým stupněm zpracování vyznačují nízkým obsahem BA.22
Byly srovnány vzorky českých a zahraničních sýrů. Koncentrace BA v českých sýrech jsou nižší nebo porovnatelné s koncentracemi BA v sýrech zahraniční výroby s výjimkou brynzy a tvarůžků, což je mimo jiné i v souladu s dřívějšími poznatky.23 Byly srovnány vždy komerční vzorky sýrů stejného typu odebrané ve stejnou dobu ( ± 1 týden) před ukončením doby maximální trvanlivosti. Výsledky mohou být ovlivněny rozdílnou dobou zrání jednotlivých vzorků (zejména u sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou), avšak počet těchto vzorků v daném souboru byl nízký (obvykle jednotky %).
Profil BA byl sledován i u tavených sýrů. Obsah BA u českých sýrů je srovnatelný se zahraničními výrobky. Ve studii bylo potvrzeno, že koncentrace BA u tavených sýrů jsou nižší než u tvrdých sýrů,24 i když byly nalezeny vzorky, kdy zejména ochucené tavené sýry vykazovaly zvýšené hladiny BA, což zřejmě souviselo s použitím výchozí suroviny nižší kvality.23
Na základě námi získaných výsledků o profilu BA a s přihlédnutím k toxikologickým aspektům byly zhodnoceny jednotlivé typy sýrů z hygienicko-toxikologického hlediska. Při použití nejvyššího přípustného množství BA uváděného Spanierem et al.7 ve výši 900 mg/kg (Σ histamin+tyramin+putrescin+kadaverin) byla tato hodnota překročena celkem u zhruba 8 % vzorků sledovaného souboru (tj. u 17 vzorků z 215 ) zastoupení jednotlivých typů sýra v tomto 8% souboru (je znázorněno v grafu 1). Při hodnocení je třeba brát v úvahu, že výsledek může být ovlivněn rozdílným počtem vzorků daného typu (n= 8 až n=35) a v rámci daného typu i zastoupením jednotlivých sýrů. Rizikovým skupinám osob nelze doporučit ke konzumaci měkké zrající sýry a z tvrdých sýrů parmazán a ementál. Plísňové sýry mohou být rovněž příčinou alimentárních intoxikací.
graf 1
Závěr
Koncentrace BA v sýrech české produkce jsou srovnatelné s obsahy BA v sýrech téhož typu zahraniční výroby. Ve většině případů mají české tvrdé i tavené sýry vyšší obsah tyraminu než histaminu, u velké části sýrů zahraniční produkce sýr s vysokým obsahem histaminu má vysoký obsah tyraminu. Studie prokázala, že je možné sýry podle profilu BA s přihlédnutím na nejvyšší přípustné množství BA rozdělit na sýry s vysokými koncentracemi BA (měkké zrající sýry, sýry s vysokodohřívanou sýřeninou), se zvýšenou koncentrací BA (s nízkodohřívanou sýřeninou, plísňové sýry resp. sýry kozí) a sýry s nízkou koncentrací BA (smetanové, termizované měkké sýry). Protože nejsou dosud definovány hygienické limity pro BA v sýrech, nelze určit hraniční hodnoty pro jednotlivé aminy. Proto se užívá pro hygienicko-toxikologické zhodnocení návrhu nejvyššího přípustného množství dle Spaniera et al. Podle tohoto kriteria byly mezi sýry s vysokými obsahy BA zařazeny sýry, u nichž bylo stanoveno nejčastější ( 70 % ) překroční tohoto množství, ale i nejvyšší hodnoty jednotlivých BA. Naopak mezi sýry s nízkými obsahy BA byly zařazeny sýry, u nichž nebyly BA prokázány nebo stanoveny jen ve stopovém množství. Ke konzumaci rizikovým skupinám osob nelze doporučit všeobecně měkké zrající sýry, sýry s vysokodohřívanou sýřeninou, případně vybrané plísňové sýry, naopak pro pacienty léčené léky s MAO lze doporučit konzumovat např. smetanové sýry a termizované měkké sýry.
Další prevence rizika jsou založena na opatřeních při výrobě a skladování sýrů. Vzniku sekundární kontaminace lze zabránit dodržováním správné hygienické a výrobní praxe. Obsah BA lze snížit pasterací mléka, testováním startovacích kultur na dekarboxylázovou aktivitu, volbou kratších dob fermentace, skladování vstupních surovin a sýrů za vhodných podmínek, zejména aplikace nízkých teplot pro inhibici aktivity dekarboxyláz.
Práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MSM 6215712402 „Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin“
Literatura:
1. ten Brink, B., Damink, C., Joosten, H. M. L. J., Huis in´t Velt, J. H. J. Occurrence and formation of biologically active amines in foods. Int J Food Mikrobiol 1990;11:73-84.
2. Halász, A., Baráth, A., Simon-Sarkadi, L., Holzapfel, W. Biogenic amines and their production by microorganisms. Trends Food Sci Technol 1994;5:42-49.
3. Karovičová, J., Kohajdová, Z. Biogenic Amines in Food. Chem Papers 2005;59:70-79.
4. Stratton, J. E., Hutkins, R. W., Taylor, S. L. Biogenic amines in cheese and other fermented foods: a review. J Food Protect 1991;54:460-470.
5. Bardócz, S., Grant, G., Brown, D. S., Ralph, A., Pusztai, A. Polyamines in food implications for growth and health. J Nutr Biochem 1993;4:66-71.
6. Komprda, T. Biogenní aminy a polyaminy ve fermentovaných potravinách živočišného původu. Veterinářství 2005;55:646-650
7. Spanier, M. C., Bruin, T. J. F., van Roode, B. A. S. W. HPLC determination of biogenic amines and evaluation of results. Food Policy Trends in Europe 1991;6(15):213.
8. Anonym: Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny
9. Roig-Sagués, A. X., Molina, A. P., Hernández-Herrero, M. Histamine and tyramine forming microorganisms in Spanish traditional cheese.Eur Food Res Technol 2002;25:95-100.
10. Křížek, M., Kalač, P. Biogenní aminy v potravinách a jejich role ve výživě. Czech J Food Sci 1998;16:151-159.
11. Standara, S., Veselá, M., Drdák, M. Determination of biogenic amines in cheese by ion exchange chromatography. Nahrung 2000;44(1):28-31.
12. Sieber, R., Lavanchy, P. Gehalt an biogenen Aminen in Milchprodukten und in Käse. Mitt Gebiete Lebensm Hyg 1990;81:82-105.
13. Polo, M. C., Ramos, M., Sanchez, R. Free amino acids by high performance liquid chromatography and peptides by gel elekctrophoresis in Mahon cheese during ripering. Food Chem 1985;16:85-96.
14. Silla - Santos, M. H. Biogenic amines: their importance in foods. Int J Food Microbiol 1996;29:213-231.
15. Pinho, O., Ferreira, I. M. P. L. V. O., Mendés, E. - Oliveira, B. M., Ferreira, M. Effect of temperature on evolution of free amino acid and biogenic amine contents during storage of Azeitão cheese. Food Chem 2001;76:287-291.
16. Antila, P., Antila, V., Mattila, J., Hakkarainen, H. Biogenic amines in cheese.1. Determination of biogenic amines in Finnish cheese using high performance chromatography. Milchwissenschalft 1984;39:81-89.
17. Askar, A., Treptow, H. Biogene Amine in Lebensmitteln: Vorkommen, Bedeutung und Bestimmung. Stuttgart, Germany; Ulmer, 1986:197.
18. Greif, G., Greifová, M., Drdák, M. Stanovenie biogénnych aminov v potravinách živočišného povodu metodou HPLC. Potr Vědy 1997;15:119-129.
19. Suhaj, M., Kováč, M. Prírodné toxikanty a antinutriční látky v potravinách. Bratislava; VÚP, 1996:140.
20. Standara, S., Veselá, M., Standarová, E. Profil a distribuce biogenních aminů v sýrech s vnitřní modrou plísní In: XXXVIII Symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin. Skalský Dvůr; VÚPP, 2007:55-59.
21. Komprda, T., Smělá, D., Novická, K., Kalhotka, L., Šustová, K., Pechová, P. Content and distribution of biogenic amines in Dutch-type hard cheese. Food Chem 2007;102:129-137.
22. Rak, L. Biogenne aminy v serach. Medycyna Wet 2005;61:391-393.
23. Standara, S. Biogenic amines in cheese and health risk. In: Contaminants and other risk substances in food and ecosystems, XIII. Praha;1998:28-30.
24. Křížek, M., Kalač, P. Současný pohled na biogenní aminy v potravinách. Kontakt 2002;7:53-56.
Adresa autora:
MVDr. Eva Standarová
Ústav hygieny a technologie mléka
FVHE VFU
Palackého 1 – 3
612 42 Brno
