J. BERNARDY1, K. NECHVÁTALOVÁ,2, J. KREJČÍ,2 P. ŠAMÁNKOVÁ,2 M. FALDYNA,1,2
1Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
2Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno
Veterinářství 2008;58:630-635.
SOUHRN
Bernardy, J., Nechvátalová, K., Krejčí, J., Šamánková, P., Faldyna, M. Intradermální aplikace antigenu – znovuobjevená cesta imunizace.
Cílem práce bylo informovat odbornou veterinární veřejnost o zkušenostech autorů s intradermální aplikací antigenu u prasat. Z provedených vakcinací, ať již modelovým antigenem či komerční vakcínou, ve kterých byla podrobně sledována humorální i buněčná imunitní odpověď, vyplynulo, že selata jsou schopna plné imunitní odpovědi na intradermálně podaný antigen od 28. dne stáří. I když reagují i na dřívější imunizaci, intenzita této odpovědi je úměrná zvyšujícímu se věku. Nicméně, po reimunizaci již nejsou patrné rozdíly mezi věkovými skupinami. Výsledky dalšího experimentu dokládají, že překonání kolostrální imunity se zdařilo lépe u selat imunizovaných intradermálně v porovnání s intramuskulární aplikací. Zejména buňkami zprostředkovaná imunitní odpověď jak u skupiny s kolostrálními protilátkami tak bez nich byla výraznější po intradermálním podání antigenu. V experimentu, který kombinoval vakcinaci s experimentální infekcí, bylo na modelu aktinobacilové pleuropneumonie prokázáno, že intradermální vakcinace navozuje chráněnost proti této infekci u selat po odstavu při nejmenším plně srovnatelnou s chráněností, vytvořenou intramuskulární aplikací vakcíny.
SUMMARY
Bernardy, J., Nechvátalová, K., Krejčí, J., Šamánková, P., Faldyna, M. Intradermal application of an antigen – rediscovered way of immunization.
The aim of this paper was to inform veterinary public on authors´ experience with an intradermal application of antigen in pigs. Using experiments performed with either model antigen or commercial vaccine associated with a characterization of humoral and cell-mediated immunity, it was shown that piglets are able to mount full immune reaction after intradermal application from 28th day of life. They are also able of earlier response but the intensity is mature-related. After reimmunization, however, there is no difference between the age groups. Results of the following experiment showed that overwhelming of colostral immunity was more successful compared to intramuscular application; mainly cell-mediated immunity was higher after intradermal administration. The last experiment combined vaccination and experimental infection of Actinobacillus pleuropneumoniae. Obtained results proved that intradermal vaccination leads to the at least the same or better protection as intramuscular vaccination.
1. Imunitní systém kůže
Kůže tvoří rozhraní mezi vnitřním a vnějším prostředím a je mechanickou, chemickou a s přispěním mikrobiální kolonizace (uvádí se 0,1 – 10 x 106 mikroorganismů/cm2) také biologickou bariéru, která chrání organismus před infekčními agens.
V případě překonání této bariéry dojde nejprve k aktivaci nespecifických imunitních mechanismů – humorálních i buněčných, včetně tkáňových makrofágů, neutrofilních granulocytů a žírných buněk.. V této fázi hrají důležitou roli také keratinocyty, buňky epidermis, které plní nejen roli mechanického krytu, ale mají rovněž schopnost rozpoznat agens pomocí receptorů specifických pro molekuly nacházející se na mikroorganismech (např. pro lipopolysacharid) a reagovat na zevní podněty sekrecí širokého spektra biologicky aktivních látek – interleukinů, chemokinů, interferonů a dalších cytokinů, které se účastní rozvoje a regulace imunitní reakce.1-3
Imunitní systém kůže je za určitých okolností schopen indukovat rovněž specifickou imunitní odpověď, a to zejména při překonání bariérových funkcí kůže, kdy dojde k aktivaci dendritických buněk. Dendritické buňky (DC) jsou výjimečné, antigen prezentující buňky, protože jako jediné jsou schopny nejen zpracovaný antigen nabídnout naivnímu T lymfocytu, ale jsou zároveň klíčovými modulátory imunitní odpovědi ovlivňující další diferenciaci T lymfocytů směrem k Th1 nebo Th2 odpovědi. DC nacházející se v kůži patří z hlediska vývoje k myeloidní linii a jsou dvojího typu. Jedny se nachází v epidermis a jsou označovány jako Langherhansovy buňky. Druhou populací jsou DC v dermis, tzv. dermální dendritické buňky. Imunologická role těchto buněk je v současné době intenzivně studována.4 Obecně jsou DC schopny přijmout a zpracovat antigeny a jako tzv. závojové buňky vcestovat do regionální mízní uzliny. Jako tzv. interdigitující dendritické buňky zde prezentují zpracovaný antigen lymfocytům a tím zahajují specifickou imunitní odpověď.5-7 Doposud nezodpovězenou otázkou zůstává, jak, a zda vůbec, spolu souvisí imunitní systém kůže a sliznic.8,9
2. Intradermální aplikace antigenu a její praktické využití v medicíně
Intradermální (i. d.) aplikace vakcíny je způsob, kterým je možné dopravit antigen do imunologicky dobře vybaveného a připraveného systému kůže. Aplikace do kůže byla použita poprvé již v roce 1796, a to Edwardem Jennerem, jako první metoda imunizace proti pravým neštovicím pomocí antigenu kravských neštovic. I. d. aplikace vakcín je v současné době perspektivní a intenzivně zkoumaná oblast vakcinologie, neboť umožňuje oproti intramuskulárnímu (i. m.) podání použití nižšího množství antigenu. Dalšími nezanedbatelnými výhodami i. d. aplikace, a to především bezjehelné, je zamezení, či výrazné omezení přenosu patogenů při vakcinaci, snížení stresujících faktorů a bolestivosti, provázející injekční aplikaci, usnadnění a zrychlení provedení rutinních úkonů pro vakcinující personál.
Bezjehelnou technikou aplikace vakcín a dalších přípravků se zabývá několik společností. Samotný přístroj, vhodný k tlakové aplikaci, vyrábí např. společnosti Bioject (USA) nebo Akra (Francie). I. d. aplikací se zabývá jak francouzská farmaceutická společnost Merial (přístroj Pigjet), tak nizozemský Intervet (přístroj I.D.A.L.), americká vývojová pobočka švýcarské společnosti Novartis (Fulton) i americký Pfizer.
I. d. vakcinace je v humánní medicíně používána v prevenci proti influenze, neštovicím, tetanu, spalničkám, alergické rýmě, včelímu bodnutí, ale i vzteklině10-14 a dalším specifickým nákazám. Pro veterinární použití je v ČR pro i. d. aplikaci registrováno několik vakcín – proti aktinobacilové pleuropneumonii prasat, července prasat, moru a myxomatóze králíků od společností Intervet, Bioveta a Dyntec, ve světě je m. j. testována intradermální vakcína proti viru prasečího reprodukčního a respiračního syndromu15 a Aujeszkyho nemoci.16
Ve vakcinologickém výzkumu je i. d. aplikace antigenu rovněž jednou z nejvíc testovaných cest podání tzv. DNA vakcín.17
Samotní výrobci bezjehelných automatů navrhují široké použití intradermální aplikace, tedy nejen k aplikaci vakcín, ale rovněž pro podávání látek tišících bolest, přípravků antimikrobiálních a snižujících příznaky zánětů u přetrvávajících bolestivých stavů.
Určitým nedostatkem i. d. aplikace, který je výraznější v terénní veterinární praxi, je nedostatečná kontrola správné aplikace. To ve svém důsledku vede k nenavození imunitní odpovědi u některých jedinců po vakcinační akci a tím k možnému rozvoji onemocnění. Tento fakt následně vede k nedůvěře vůči i. d. aplikace jako takové.
3. Naše zkušenosti s intradermální aplikací u prasete
Naše zkušenosti s i.d. aplikací antigenu u prasete se týkají tří oblastí. V první skupině experimentů jsme testovali schopnost imunitního systému novorozených selat zpracovat i. d. aplikovaný antigen a odpovědět na jeho aplikaci imunitní odpovědí. Na tyto experimenty navazovala sledování možnosti indukovat aktivní imunitní odpověď pomocí i. d. aplikace antigenu u selat s pasivně přijatými antigenně specifickými protilátkami z kolostra. Posledním experimentem bylo srovnání imunitní odpovědi indukované i. d. a i. m. aplikací antigenu, která byla měřena pomocí experimentální infekce.
3.1 Imunitní odpověď v ranném postnatálním období
Imunitní systém selat prodělává v prvních týdnech po narození strukturální a funkční změny, můžeme říci, že dozrává.18 Některými autory je toto období popisováno jako období tzv. ,imunodeficience – teprve po čtvrtém týdnu se podle některých autorů dostává schopnost odpovídat na antigenní podnět na úroveň dospělých zvířat.19
Na našich pracovištích jsme se zaměřili na sledování schopnosti aktivní tvorby protilátek a buněčné imunitní odpovědi po i. d. aplikaci modelového antigenu v ranném postnatálním období. Modelový antigen (protein zvaný keyhole limpet hemocyanin) bez adjuvans byl aplikován 3denním, 7denním, 14denním a 28denním selatům. Za tři týdny po primoimunizaci byla selata stejným způsobem reimunizována. V pravidelných intervalech byl selatům odebírán vzorek krve na imunologické vyšetření.
Z grafu 1a, b je patrné, že schopnost zpracovat i. d. aplikovaný antigen a odpovědět na něj protilátkovou odpovědí jak izotypu IgM, který je typický pro primární odpověď, tak izotypu IgG, který je charakteristický spíše pro sekundární odpověď, byla u selat imunizovaných 3. a 7. den po porodu menší, než u selat imunizovaných v pozdějším věku. Nicméně po reimunizaci byla intenzita odpovědi srovnatelná nezávisle na věku v době primoimunizace.
Buněčná imunita indukovaná imunizací byla zkoumána in vitro stimulací lymfocytů selat modelovým antigenem v tzv. testu blastické transformace lymfocytů. Intenzita buněčné imunitní odpovědi se shodně s protilátkovou odpovědí zvyšovala s věkem selat v době primoimunizace. Tyto změny v intenzitě imunitní odpovědi po i. d. aplikaci antigenu mohou alespoň částečně souviset s růstem podkožní tkáně a zmnožením dendritických buněk se vzrůstajícím věkem selat (obr. 1a, b).
graf 1a, b
obr 1a, b
3.2 Imunitní odpověď selat s kolostrálními protilátkami
Informace o tom, že mláďata hospodářských zvířat mají nedostatečně vyzrálý imunitní systém, velmi často vychází ze sledování nedostatečné imunitní odpovědi na vakcinaci v časném věku. K nedostatečné odpovědi dochází díky částečné specifické inhibici kolostrálními protilátkami přetrvávajícími v krevním oběhu mláďat. Podle převládajících představ hladina kolostrálních protilátek v určitém okamžiku poklesne natolik, že již nejsou schopny chránit před infekcí, avšak současně ještě blokují nástup aktivní imunity. Pro toto období, které nelze překrýt aktivní imunizací, se vžil název imunitní okno.20 Na druhé straně naše předchozí výsledky21,22 i výsledky jiných autorů23-25 naznačují, že specifická inhibice se týká pouze odpovědi na první aplikaci, po revakcinaci má imunitní odpověď spíš charakter sekundární odpovědi. Zdá se, že období imunitního okna by se dalo obejít a překonat nejen vhodným načasováním vakcinací a použitím adjuvans s imunomodulačními látkami, ale rovněž lokální aplikací antigenů, např. i. d., kdy dochází k jinému typu antigenní prezentace a do jisté míry odlišné imunitní odpovědi.
Proto jsme v navazující studii zkoumali schopnost selat s pasivně přijatými kolostrálními protilátkami odpovědět tvorbou aktivní imunity na i. d. imunizaci. Studie byla provedena na čtyřech skupinách selat: dvě se narodily prasnicím, které byly imunizovány modelovým antigenem (a proto měly v kolostru specifické protilátky proti tomuto antigenu), a dvě se narodily prasnicím neimunizovaným. Selata byla ve třetím týdnu života imunizována a za tři týdny reimunizována antigenem a to bud i. d. nebo i. m.
V dynamice protilátkové odpovědi nebyl rozdíl mezi oběmi cestami aplikace antigenu (graf 2a). U skupin selat, která přijala kolostrum bez protilátek proti použitému antigenu, byl zaznamenán charakteristický průběh protilátkové imunitní odpovědi po primo- a reimunizaci. U skupin selat, která přijala kolostrum s vysokým obsahem protilátek proti antigenu, nedošlo po primoimunizaci k výraznému nárůstu titru specifických protilátek. Naopak po reimunizaci reagoval imunitní systém selat zrychlenou tvorbou IgG protilátek, která svědčí o aktivní imunitní reakci, navozené předchozí imunizací.
Naopak měřením buněčné imunitní odpovědi byly nalezeny rozdílné výsledky u skupin selat imunizovaných i. d. a i. m.. Lymfocyty izolované z krve selat imunizovaných i. d. vykazovaly vyšší antigenně specifickou imunitu ve srovnání se selaty, kterým byl antigen podán i. m. (graf 2b).
graf 2a, b
3.3 Ověření účinnosti vytvořené imunity experimentální infekcí
Účinnost i. d. aplikace antigenu byla také zkoumána na skupinách selat vakcinovaných i. d. nebo i. m. proti aktinobacilové pleuropneumonii (APP) a skupině nevakcinované – kontrolní. Selata byla následně vystavena experimentální aerogenní infekci. Odolnost byla hodnocena pomocí hladiny vytvořených protilátek a na základě plicního skóre selat za týden po provedené infekci.
Selata byla bez kolostrálních protilátek proti APP. Vakcinace byla provedena v době, která se nejčastěji vyskytuje i v běžných vakcinačních schématech proti této chorobě – primo- a revakcinace byla provedena v šesti a devíti týdnech života. Byla použita komerční vakcína proti APP (Suivac APP, Dyntec, CZ) jak pro i. d., tak i. m. podání. Pravidelně byly odebírány vzorky sér za účelem stanovení hladin specifických protilátek.
Ve věku 12 týdnů byla provedena experimentální infekce kmenem APP, biotyp 1, sérotyp 9 ve čtvrté pasáži (izolát KL2-2000, získaný z odd. bakteriologie VÚVeL Brno). Použitý kmen byl klasifikován jako vysoce patogenní sérotyp, vyvolávající akutní průběh s vysokým stupněm morbidity a mortality. Stejný kmen byl použit při dříve popsaných experimentech21,26,27 a patří k nejčastěji se objevujícímu sérotypu 9 Actinobacillus pleuropneumoniae v ČR a dalších evropských státech.28
Zdravotní stav a teploty po experimentální infekci byly kontrolovány denně. Zvířata byla bezbolestně utracena po sedmi dnech a podrobena patologicko anatomickému vyšetření. Plíce byly vyšetřeny zvlášť a jejich stav byl zhodnocen pomocí plicního skóre,29 kde stupeň napadení infekčním agens je hodnocen v procentech změněné plicní tkáně, orientačně je celkový objem plic hodnocen jako 100 %, kraniální a akcesorní laloky 5 – 15 %, a diafragmatické laloky 25 – 30 %.
Z grafu 3a je patrné, že obě cesty vakcinace vedly k indukci tvorby specifických protilátek. U selat vakcinovaných i. d. byla hladina těchto protilátek mírně nižší a to jak po primovakcinaci tak i po revakcinaci. Naopak, klinické projevy plicního onemocnění, manifestované kašlem, febrilními stavy a celkovou skleslostí byly výraznější u skupiny vakcinované i. m.
Plicní skóre u obou vakcinovaných skupin bylo významně nižší a stav plic tedy lepší než u kontrolní skupiny (graf 3b). Vakcinací nebývá dosaženo plné chráněnosti, přesto postižení plic imunizovaných zvířat je významně menší. Zejména protilátky proti APX toxinům jsou považované za nejvýznamnější při ochraně plic při onemocnění APP.30,31 Navíc jsme nalezli rozdíly mezi oběma způsoby vakcinací ve prospěch i. d. vakcinace, i když statisticky nevýznamné. Paradoxně nižší hladiny IgG v séru po i. d. vakcinaci a vyšší stupeň chráněnosti plic by mohl být vysvětlen indukcí i buněčné imunitní odpovědi nebo nějakým vztahem mezi imunitním systémem kůže a sliznic a indukcí i slizničního typu odpovědi po i. d. aplikaci.
graf 3a, b
4. Praktická aplikace poznatků
Z provedených imunizací, ať již modelovým antigenem či komerční vakcínou, ve kterých byla podrobně sledována humorální i buněčná imunitní odpověď, vyplynulo, že:
• selata jsou schopna plné humorální a buněčné imunitní odpovědi na i. d. podaný antigen od 28. dne stáří. I když reagují i na dřívější imunizaci, intenzita této odpovědi je úměrná zvyšujícímu se věku. Nicméně, po reimunizaci již nejsou patrné rozdíly mezi věkovými skupinami.
• překonání kolostrální imunity se zdařilo lépe u selat imunizovaných i. d. vakcínou v porovnání s i. m. aplikací. Zejména buňkami zprostředkovaná imunitní odpověď jak u skupiny s kolostrálními protilátkami tak bez nich byla výraznější po i. d. podání antigenu.
• i. d. vakcinace navozuje chráněnost proti APP u selat po odstavu, při nejmenším plně srovnatelnou s chráněností, vytvořenou i. m. aplikací vakcíny.
•
Autoři by rádi poděkovali spolupracovníkům, kteří se podíleli na vzniku dat, prezentovaných v této práci, Ing. Ivě Brázdové z VFU a pí. Haně Kudláčkové, Evě Kotlářové a Ing. Lence Levé a MVDr. Zdeňce Kučerové z VÚVeL Brno.
Data vznikla za finanční podpory projektů Ministerstva zemědělství České republiky (1B44024 a MZE0002716201).
Literatura:
1. Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2005;4:329-334.
2. Pivarcsi, A., Kemény, L., Dobozy, A. Innate immune functions of the keratinocytes. A review. Acta Microbiol Immunol Hung 2004;51:303-310.
3. Schröder, J. M., Reich, K., Kabashima, K. et al. Who is really in control of skin immunity under physiological circumstances - lymphocytes, dendritic cells or keratinocytes? Exp Dermatol 2006;15:912-929.
4. Mathers, A. R., Larregina, A. T. Professional antigen-presenting cells of the skin. Immunol Res 2006;36:127-136.
5. Lappin, M. B., Kimber, I., Norval, M. The role of dendritic cells in cutaneous immunity. Review. Arch Dermatol Res 1996;283:109-121.
6. Romani, N., Holzmann, S., Tripp, C. H., Koch, F., Stoitzner, P. Langerhans cells - dendritic cells of the epidermis. Review. APMIS 2003;111:725-740.
7. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: Translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol 2006;311:17-58.
8. Enioutina, EY., Visic, D., Daynes, R. A. The induction of systemic and mucosal immune responses to antigen-adjuvant compositions administered into the skin: Alterations in the migratory properties of dendritic cells appears to be important for stimulating mucosal immunity. Vaccine 2000;18:2753-2767.
9. John, M., Bridges, E. A., Miller, A. O., Calderwood, S. B., Ryan, E. T. Comparison of mucosal and systemic humoral immune responses after transcutaneous and oral immunization strategies. Vaccine 2002;20:2720-2726.
10. Belshe, R. B., Newman, F. K., Cannon, J. et al. Serum antibody responses after intradermal vaccination against influenza. N Engl J Med 2004;351:2286-2294.
11. Elisberg, B. L., McCown, J. M., Smadel, J. E. Vaccination against smallpox. Jet injection of chorio-allantoic membrane vaccine. J Immunol 1956;77:340-351.
12. Dimache, G., Stoean, C., Durbaca, S., Lascu, N., Croitoru, M., Dimache, A. Experimental study on intradermal antitetanus antityphoid immunization. Microbiol Immunol 1992;51:53-65.
13. Cooper, C., Morley, D. C., Weeks, M. C., Beale, A. J. Administration of measles vaccine by Dermojet. Lancet 1966;1:1076-1077.
14. Burridge, M. J., Baer, G. M., Sumner, J. W., Sussman, O. Intradermal immunization with human diploid cell rabies vaccine. Serological and clinical responses of persons with and without prior vaccination with duck embryo vaccine. JAMA 1982;248:1611-1614.
15. Martelli, P., Cordioli, P., Alborali, L. G. et al. Protection and immune response in pigs intradermally vaccinated against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) and subsequently exposed to a heterologous European (Italian Cluster) field strain. Vaccine 2007;25:3400-3408.
16. Artursson, K., Lindersson, M., Varela, N., Scheynius, A., Alm, G. V. Interferon-alpha production and tissue localization of interferon-alpha/beta producing cells after intradermal administration of Aujeszky's disease virus-infected cells in pigs. Scand J Immunol 1995;41:121-129.
17. Barfoed, A. M., Kristensen, B., Dannemann-Jensen, T. et al. Influence of routes and administration parameters on antibody response of pigs following DNA vaccination. Vaccine 2004;22:1395-1405.
18. Nechvátalová, K., Krejčí, J., Zelníčková, P. et al. Postnatální vývoj imunitního systému prasat. Veterinářství 2008;58:187-192.
19. Metzger, J. J., Ballet-Lapierre, C., Houdayer, M. Partial inhibition of the humoral immune response of pigs after early postnatal immunization. Am J Vet Res 1978;39:627-631.
20. Chappuis, G. Neonatal immunity and immunisation in early age: Lessons from veterinary medicine. Vaccine 1998;16:1468-1472.
21. Nechvátalová, K., Knotigová, P., Krejčí, J. et al. Significance of different types and levels of antigen-specific immunity to Actinobacillus pleuropneumonie infection in piglets. Vet Med - Czech 2005;50:47-59.
22. Toman, M., Pokorova, D., Faldyna, M. The dynamics and isotype characterization of colostral antibodies to parvovirus in newborn pups. Immunol Lett 2003;87:162.
23. Kit, S., McConnell, S., Kit, M., Lawhorn, B. Circumvention of maternal antibody interference by immunization of newborn pigs with glycoprotein GIII-deleted marker vaccine. Immunol Cell Biol 1993;71:421-430.
24. Sarvas, H., Kurikka, S., Seppala, I. J., Makela, P. H., Makela, O. Maternal antibodies partly inhibit an active antibody response to routine tetanus toxoid immunization in infants. J Infect Dis 1992;165:977-979.
25. Symons, D. B., Clarkson, C. A., Binns, R. M. Antibody response to dinitrophenyl hapten by foetal, neonatal and young pigs. Immunology 1983;48:703-711.
26. Krejčí, J., Nechvátalová, K., Kudláčková, H., Faldyna, M., Kučerová, Z., Toman, M. Systemic and local antibody responses after experimental infection with Actinobacillus pleuropneumoniae in piglets with passive or active immunity. J Vet Med B 2005;52:190-196.
27. Faldyna, M., Nechvátalová, K., Šinkora, J. et al. Experimental Actinobacillus pleuropneumoniae infection in piglets with different types and levels of specific protection: Immunophenotypic analysis of lymphocyte subsets in the circulation and respiratory mucosal lymphoid tissue. Vet Immunol Immunopathol 2005;107:143-152.
28. Šatrán, P., Nedbalcová, K. Prevalence of serotypes, production of Apx toxins, and antibiotic resistance in strains of Actinobacillus pleuropneumoniae isolated in the Czech Republic. Vet Med Czech 2002;47:92-98.
29. Christensen, G., Sorensen, V., Mousing, J. Diseases of the respiratory system. In Diseases of Swine; Straw, B. E., D'Allaire, S., Mengeling, W. L., Taylor, D. J., Eds.; Ames, Iowa, USA, 1999; Chapter 61.
30. Haesebrouck, F., Chiers, K., VanOverbeke, I., Ducatelle, R. Actinobacillus pleuropneumoniae infections in pigs: the role of virulence factors in pathogenesis and protection. Vet Microbiol 1997;58:239-249.
31. Bosse, J. T., Johnson, R. P., Nemec, M., Rosendal, S. Protective local and systemic antibody responses of swine exposed to an aerosol of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1. Infect Immun 1992;60:479-484.
Adresa autora:
MVDr. Jan Bernardy
Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Palackého 1-3
612 42 Brno
