L. Pažout, P. Flachsel
Úvod do problematiky
Původcem onemocnění reprodukčního a respiračního syndromu u prasat (PRRS) je RNA virus z čeledi Arteriviridae. Jedná se o malý obalený virus o velikosti 60 nm s jednořetězcovou RNA s pozitivní polaritou. Velikost genomu je asi
15 kilobasí (kb). Genom je rozdělen do 9 otevřených čtecích rámů (ORF).
ORF 1a a 1b kóduje funkční proteiny, které jsou zodpovědné za replikaci a transkripci virové RNA. Ostatní ORF 2a až 7 kódují strukturální proteiny viru. Transkripcí těchto ORF o celkové velikosti 3,5 kb vznikají specifické mRNA, které kódují strukturální proteiny viru. Velikost těchto proteinů se pohybuje od 15 do 50 kDa, některé z nich jsou glykosylovány. Z hlediska imunogenity jsou důležité sekvence nukleotidů v ORF 5 a ORF 7. ORF5 kóduje jeden z proteinů membrány a ORF7 kóduje protein nukleokapsidy. Přestože variabilita sekvencí ve výše zmiňovaných ORF 5 a ORF 7 evropských i severoamerických kmenů je nízká, sekvence aminokyselin, které jsou těmito ORF kódovány, jsou homologní pouze z 80 % u ORF 5 a 74 % u ORF 7.
Vzhledem k charakteru genomu (nedokonalá replikace) je virová RNA výrazně náchylná k mutacím, delecím, adicím, substitucím a intragenovým rekombinacím. Výsledkem je výrazná genetická a biologická variabilita viru PRRS. Variabilitu jednotlivých izolátů lze kvantifikovat sekvenací nukleotidů ze získaných PCR produktů. Na základě sekvenční analýzy z ORF 5, popřípadě z ORF 7 lze sestavit fylogenetický vztah mezi terénními a vakcinačními kmeny. Příslušné sekvence jsou přístupné v genové bance. Míra homologie sekvencí nukleotidů ORF 5 a ORF 7 vakcinačních kmenů v porovnání s terénními izoláty se výraznou měrou podílí na účinnosti připravených vakcín.
Další molekulární charakteristiku kmenů lze provést metodou RFLP, to je sledováním polymorfismu PCR produktů po rozštěpení restrikčními enzymy a rozdělení na agarózovém gelu.
Strategie managementu v chovu postiženém PRRS
U větších chovů, které se potýkají s infekcí PRRS, lze doporučit provedení sekvenace izolovaných virů PRRS. Získané výsledky srovnání vakcinačních a terénních izolátů lze využít při rozhodování jakou vakcínou vakcinovat. Genotyp izolovaných kmenů lze rovněž porovnat s genotypy ostatních kmenů vyskytujícími se v okolních chovech či v dané lokalitě nebo teritoriu v rámci epizootologické analýzy nákazové situace.
Příbuznost jednotlivých variant PRRS je ilustrována dendogramem, fylogenetickým stromem (obrázek číslo 1), který vyjadřuje procento homologie specifikovaných úseků sekvencí nukleotidů jednotlivých kmenů viru PRRS.
Pro úspěšný management rozhodování jsou důležité nejen výsledky úvodního monitoringu sekvenace izolovaných virů PRRS, ale i další následné pravidelně prováděné izolace virů a jejich genetické vyšetření. Při manifestaci klinického onemocnění a zhoršení reprodukčních ukazatelů nám tyto genetické analýzy pomohou objasnit, zda v chovu došlo:
- k výskytu nových variantních kmenů v souvislosti se zařazením nových zvířat do chovu nákupem či přesunem z jiné lokality
- k výskytu nových variant, které jsou podobné, popřípadě homologní s živými vakcinačními kmeny při použití živých vakcín
- k výskytu nových variant v důsledku selekčního tlaku při používání monoantigenních vakcín.
Materiál a metody
Genotypizace terénních izolátů T-2004, T-2005a,
T-2005b, T-2005c, T-2005d, T-2005t a vakcinačních kmenů VD-E1, VD-E2 a VD-A1 byla provedena sekvenací nukleotidů (nt) ze získaných PCR produktů.
Na základě sekvenční analýzy 240 nt z ORF7 byl sestaven fylogenetický vztah vakcinačních kmenů a terénních izolátů k ostatním vakcinačním kmenům a izolátům PRRS, jejichž příslušné sekvence byly vyhledány v genové bance.
Výsledky
Jak vyplývá z fylogenetického stromu, je vakcinační kmen VD-E1 evropský genotyp blízce příbuzný evropskému referenčnímu kmenu LV-N. VD-E2 kmen představuje signifikantně odlišnou podskupinu s vyšší variabilitou nukleotidů s porovnání s VD- E1. Severoamerický kmen VD-A1 je heterologní ve srovnání s kmenem VR2332 a je geneticky příbuzný s podskupinou kanadských izolátů (IAF). Jak vyplývá z dendogramu, čtyři izoláty (T-2005a, T-2005b, T-2005c a T-2004) z chovů v České republice jsou geneticky příbuzné podskupině evropských izolátů EU-a. Dva izoláty (T-2005t a T-2005d) jsou geneticky příbuzné podskupině evropských izolátů EU-b. Severoamerický kmen (P649-05) izolovaný v České republice v roce 2005 je příbuzný s referenčním severoamerickým kmenem VR2332.
Závěr
Z výsledků vyplývá, že se v České republice vyskytuje široká škála variantních kmenů jak z klastru evropských (EU-a, EU-b), tak i severoamerických (SA) kmenů. Tato situace je obdobná i v ostatních evropských zemích. Pro úspěšné zdolávání nákazy PRRS lze před vakcinací doporučit provedení genotypizacie izolátů viru PRRS. Zjištěné výsledky genetických a imunologických vlastností těchto izolátů by po porovnání s obdobnými vlastnostmi vakcinačních kmenů měly sloužit k rozhodnutí, jakou vakcínu použít k aktivní imunizaci prasat. Zdali zvolit živou vakcínu s rizikem vzniku možných komplikací, monoantigenní inaktivovanou vakcínu nebo polyantigenní inaktivovanou vakcínu s širším spektrem účinnosti.
