M. Bisgaard, H. Christensen, A.M. Bojesen a J.P. Christensen
Úvod
Existovala představa, že čeleď Pasteurellaceae (Pohl, 1981) pojme velkou skupinu gramnegativních, chemoorganotrofních, fakultativně anaerobních a fermentačních bakterií včetně rodu Pasteurella (Trevisan, 1887), Actinobacillus (Brumpt, 1910), Haemophilus (Winslow a kol., 1917) a mnoho dalších skupin organismů, které vykazují fenotypovou a genotypovou příbuznost s těmito rody (Pohl, 1979; 1981). Od té doby co byla provedena taxonomie čeledi Bisgaardem (1995b) bylo zaznamenáno mnoho nových druhů a rodů. V současné době tato čeleď zahrnuje 10 rodů, 60 pojmenovaných druhů a množství ještě nepojmenovaných taxonů. Navíc se stále zvyšuje počet „genomospecies“, které reprezentují genotypově odlišné druhy bez dostatečné fenotypové různosti, která by umožnila rozdělení a pojmenování.
Vážné problémy jsou spojené s izolací a identifikací těchto organismů díky potížím při růstu a jejich charakterizování, což má často za následek slabé nebo falešně negativní výsledky testů kdy použití odlišných médií a indikátorů neumožňuje srovnávání získaných výsledků. K tomu ještě použití komerčních souprav často způsobuje, že jsou výsledky nespolehlivé (Inzana a kol., 2000). Z těchto důvodů bylo zaznamenáno mnoho případů nesprávné identifikace (např. Boot a Bisgaard, 1995; Blackall a kol., 1997, 2002), proto doporučujeme použití referenčních kmenů a poslání kmenů do referenčních laboratoří v případě, že nejsou k dispozici molekulární metody (Bisgaard, 1993, Christensen a Bisgaard, 2003, 2004).
Epidemiologie většiny druhů zůstává neobjasněná. U mnohých druhů však byla zaznamenaná specifičnost pro určitého hostitele, zatímco u ostatních se zdá, že mají spojitost s mnoha různými hostiteli (Bisgaard, 1993). Bohužel mnoho publikací neumožňuje jednoznačný výklad k určitému druhu z výše uvedených důvodů, protože poznatky o méně patogenních taxonech jsou založené pouze na systematickém zaznamenávání původu izolátů (Bisgaard, 1993). Navíc nedávná pozorování druhů získaných z mnoha hostitelů ukazují na existenci subklonů se vztahem k hostiteli (Davies a kol., 2004).
Rod Pasteurella
Rod Pasteurella dříve zahrnoval 9 pojmenovaných druhů a 2 nepojmenované taxony (Christensen a Bisgaard, 2003). Reklasifikace aviárního klastru (cluster) 18 na Gallibacterium (Christensen a kol., 2003a), Volucribacter (Christensen a kol., 2004b) a Avibacterium (Blackall a kol., 2005) omezilo tento rod tak, že zahrnuje P. multocida, P. canis, P. stomatis, P. dagmatis a nepojmenované druhy B, ze kterých je pouze P.multocida považovaný za hlavního patogena pro ptáky. Na základě genotypové podobnosti byl P.multocida nedávno reklasifikován tak, že zahrnuje biovar 2 varianty Av. avium a P. canis (Christensen a kol., 2004a). Nedávné studie také zdokumentovaly existenci dvou nových druhům podobných taxonů Pasteurella, které jsou příbuzné s P. multocida a zvláštní péče by měla být věnována identifikaci organismů podobných Pasteurelle (Christensen a kol., 2005).
Ačkoliv už je známo desetiletí, že se kmeny P. multocida značně liší ve virulenci pro drůbež, jen velmi málo toho známe o faktorech virulence. Obzvláště chybějí informace o molekulární bázi virulence. Christensen a Bisgaard (1997) udělali přehled o faktorech virulence včetně kapsule, endotoxinu a jiných toxinů, o vnějších membránových proteinech (OMP), tepelně šokových proteinech (heat shock proteins) a enzymech. Nejnovější informace o faktorech virulence potom zaznamenal Christensen a Bisgaard (2003). Stručně můžeme říct, že se pouze u dermonekrotického toxinu zjistilo, že má přímou souvislost s virulencí P. multocida, zatímco ostatní geny jsou charakterizované jako domnělé geny virulence.
Přehled epidemiologie P. multocida udělal Christensen a Bisgaard (2003). Velmi rozdílná ohniska jsou normálně způsobena jedním klonem v pracovních podmínkách. Je však třeba provést longitudinální (délkové) studie na stabilitu ohniskového klonu. Demonstrace stejného klonu ve třech ohniscích ptačí cholery u divokých vodních ptáků v Dánsku v roce 1996 a 2001 a ve Švédsku v roce 1998 ukazuje na klonovou stabilitu (Christensem a kol., 1998; nepublikované výsledky). Je třeba však důkladněji prozkoumat jestli klony spojené s výskytem jednoho živočišného druhu napadají také jiné druhy zvířat. Srovnání OMP profilů bovinních izolátů s ptačími, ovčími a prasečími kmeny ukázalo, že většina infekcí respiračního traktu u každého z těchto živočišných druhů je způsobena různými kmeny P. multocida. Ale přítomnost malého množství kmenů u více než ¨jednoho hostitelského druhu ukazuje, že také musíme brát v úvahu přenos mezi různými hostitelskými druhy.
Přehled týkající se identifikace a typizace P. multocida včetně metod založených na DNA provedli Blackall a Miffin (2000), Christensen a Bisgaard (2003). Nespecifická PCR (Miffin a Blackall, 2001) a in situ detekce (Mbuthia a kol., 2001) o kterých byla řeč v souvislosti s biovarem 2 Av. avium a P. canis následně vysvětlil Chrristensen a kol. (2004a). Avšak objevily se další problémy.
Během posledního desetiletí byl zaznamenán jen malý pokrok co se týká profylaxe a léčení cholery drůbeže a drůbežářský průmysl stále čeká na průlom v používání definovaných kmenů P. multocida jako vakcín. Tento průlom však závisí na identifikaci specifických faktorů virulence.
Rod Avibacterium
Nedávno se ukázalo, že hlavní podskupina (subcluster) v rámci aviární 16S rRNA skupiny (cluster) 18 včetně čtyř pojmenovaných druhů, které veterinární bakteriologové dobře znají (P. paragallinarum, P. gallinarum, P. avium, P. volantium) a nepojmenovaný druh P. sp. A tvoří kmenovou skupinu vzniklou z jedné roviny vývojové linie (monophyletic group) s minimálně 96,8% 16S rRNA sekvenční podobností. Protože tato skupina také mohla být oddělena fenotypově od všech poznaných a pojmenovaných taxonů v rámci Pasteurellaceae, byl pro tuto skupinu navržen nový rod Avibacterium (Blackall a kol., 2005). Zatímco se všemi vyjmenovanými druhy se běžně setkáváme při výzkumu onemocnění horních dýchacích cest ptáků, pouze Av. paragallinarum je považováno za primárního patogena, původce infekční koryzy, což je ekonomicky důležité onemocnění kuřat (Blackall, 1999).
Přehled o infekční koryze včetně diagnostických možností publikoval Blackall (1999). Stručně řečeno, byly zaznamenány dva biovary Av. paragallinarum a oba způsobují infekční koryzu. Po tom co se vyskytl NAD-nezávislý biovar 2 v Jižní Africe (Horner a kol., 1995), následně byl zaznamenán také v Mexiku. Serotypizace izolátů biovaru 2 demonstrovala existenci všech tří serovarů Page ačkoliv většina patří izolátů patří k Page serovaru A. Horner a kol. (1995) předpokládali, že izoláty biovaru 2 častěji způsobují zánět vzdušných vaků než klasické izoláty biovaru 1.
Pokud se týká P. multocida, byla naznačena řada faktorů virulence pro Av. paragallinarum včetně HA antigenů a kapsul kromě hrubých polysacharidů.
Metody molekulární typizace a serologické testy byly zaktualizovány v posledním vydání „Nemocí drůbeže“ od Blackalla a Matsumota (2003) stejně jako léčení a vakcinace. Navzdory rutinní vakcinaci běžně dostupnými komerčními vakcínami včetně trivalentních vakcín byly zaznamenány ohniska infekční koryzy z různých zemí Jižní Ameriky, Spojených států a Afriky. Následné zkoumání virulence devíti sérovarů referenčních kmenů Av. paragallinarum ukazuje, že existují rozdíly ve virulenci. Nejvyšší klinické skóre bylo určeno u sérovaru C-1 a nejnižší u C-4 (Soriano a kol., 2004a). Studie na zkříženou ochranu s těmito devíti sérovary potvrdily, že séroskupiny A, B a C představují odlišné imunovary a byla pozorována zkřížená ochrana mezi všemi čtyřmi sérovary séroskupiny A zatímco u séroskupiny C byla potvrzena snížená hladina zkřížené ochrany. Zdá se, že tetravalentní vakcína s olejovým adjuvans obsahující navíc izolát serotypu B je imunogenní vůči všem izolátům po jediné vakcinaci (Jacobs a kol., 2003).
Av. paragallinarum je citlivý organismus, který je poměrně rychle inaktivován vně hostitele.Odstranění infikovaných nebo uzdravených hejn, která představují hlavní zdroj infekce představuje tedy účinnou metodu eradikace. Protože se v rozvojových zemích neodstraní všechna naskladněná a vyskladněná produkce, může mít infekční koryza v těchto zemích větší dopad než v rozvinutých zemích.
Bylo zjištěno, že v rámci řádu Galliformes má Av. gallinarum spojitost s lézemi u Gallus domesticus, Meleagris gallopavo a Numida meleagris. Avšak bylo to potvrzeno pouze u kuřat a jednoho izolátu z krůty pomocí genetické analýzy jako je ribotypizace nebo srovnání sekvencí u genu16S rRNA. Jeden izolát od bažanta, který nevytvářel kyselinu z maltózy a dextrinu vykazoval 99,5% podobnost 16S rRNA genových sekvencí s Av. gallinarum. Identifikace toho stejného klonu Av. gallinarum ze 14 ohnisek akutního respiračního onemocnění u krůt v průběhu dvou měsíců ukazuje na společný zdroj infekce a spíše na primární než na sekundární roli Av. gallinarum v těchto ohniscích (Bisgaard a kol., 2005). Izoláty z potkanů identifikované jako Av. gallinarum pomocí konvenčních fenotypových testů patřily k odlišných ribotypovým klastrům a vykázaly pouze 93% podobnost u16S rRNA s Av. gallinarum. Z tohoto důvodu byly tyto organizmy přiděleny do nového genomového druhu a prozatímně označeny jako taxon 47.
Kmeny vyžadující V-faktor získané ze sinusitidy u koroptví a bažantů a izolované z endokarditidy kuřat představují nové kandidátské druhy Avibacterium předběžně označené jako taxon 49 a 50. A nakonec izoláty z respiračního traktu bažantů (Petersen a kol., 1998; Christensen a kol., 2003b) byly přiděleny k Avibacterium.
Rod Actinobacillus
Nedávno byl udělán přehled taxonomie organismů klasifikovaných jako Actinobacillus se zaměřením na klasifikaci a identifikaci včetně charakterizace na molekulární bázi, typizaci a identifikaci. Revidovaná definice Actinobacillu v užším smyslu zahrnuje pouze jeden aviární taxon, dříve známý jako aviární hemolytický Actinobacillu podobný organismus, který je v současné době označen jako taxon 26. Tyto organismy zahrnují 4 biovary, které se jevily jako heterogenní na úrovni druhů pomocí DNA:DNA hybridizace (Piechulla a kol., 1985). Taxon 26 byl získaný ze sinusitidy, zánětu spojivek a septikémie u vodních ptáků v Evropě a ve Spojených státech (Bisgaard, 1993).
Rod Gallibacterium
Nedávno navrhli Christensen a kol. (2003a) nový rod Gallibacterium, který zahrnuje organismy dříve známé jako aviární Pasteurella haemolytica, Actinobacillus salpingitis a Pasteurella anatis, protože tyto taxony tvoří monofyletické jednotky s podobností více než 95% na bázi srovnání sekvence 16S rRNA a nejsou příbuzné s ostatními rody čeledi Pasteurellaceae. Podobnost mezi kmeny Av. paragallinarum a kmeny patřícími do Gallibacterium se pohybovala mezi 92,7 a 94,8%, zatímco podobnost s Volucribacter a nepojmenovanými taxony 2, 3 a 34 byla podle Bisgaarda 92,2 a 93,8%.
Dosud byly zaznamenány tři druhy Gallibacterium, G. anatis a genomové druhy 1 a 2 (Christensen a kol., 2003a). Celkem bylo demonstrováno 21 různých velikostí plasmidů, které se pohybují od 1,9 do 14,5 kb. Jejich významnost je třeba ještě prozkoumat.
Přehled o projevech nemoci, patogenezi a epidemiologii provedl Bojesen (2003). Ačkoliv žádné specifické léze nebo syndromy nebyly spojeny s druhy Gallibacterium, většina zpráv indikuje predilekci na reprodukční ústrojí, což má za následek salpingitidu (zánět vejcovodu), ooforitidu (zánět vaječníku), peritonitidu a sepsi. Ale podle Bojesena (2003) byla také zaznamenána perikarditida, perihepatitida a léze horních cest dýchacích. Nedávno bylo zaznamenáno z Mexika, že se objevilo nové onemocnění kuřat způsobené G. anatis, které má vliv na reprodukční ústrojí nosnic (Vazques a kol., 2003). Závažnost lézí a ztráty v produkci vajec kolísaly podle odlišných biovarů G. anatis, které způsobily onemocnění (Gonzales a kol., 2003).
Zatím jen málo chápeme povahu infekcí způsobenou Gallibacterium. Experimentální studie s Gallibacterium ukázaly vzájemně si odporující výsledky, které mohou být vysvětleny rozdíly ve virulenci nebo faktory, které se týkají k hostitele. Nedávné výzkumy in vivo s nosnicemi s heterofilní deplecí a normálními 15 týdnů starými hnědými nosnicemi však měly za následek léze podobné předchozímu popisu přirozené infekce. Spekulace o možných faktorech virulence se týkají také RTX toxinu a kapsuly, obojí bylo demonstrováno u jiných Pasteurellaceae.
Výzkumy týkající se prevalence a přenosu hemolytických druhů Gallibacterium v dánských produkčních systémech kuřat s rozdílnou hladinou biologické ochrany (biosecurity) ukázaly, že podíl prevalence byl vysoce ovlivněn produkčním systémem a byl ve významné spojitosti s hladinou biosecurity pozorovanou u jednotlivých hejn. Infekce hejna se podobaly všem a žádnému typu kolonizace a nebyl zaznamenaný žádný důkaz o vertikálním přenosu. Následné zkoumání klonality ukázaly, že pouze jediný klon byl zřejmý u tohoto hejna. Jeden subcluster obsahoval pouze tracheální izoláty, zatímco ostatní primárně obsahovaly kloakální izoláty. Kromě kuřat byly Gallibacterium spp. izolovány z lézí krůt, bažantů, koroptví, vodních ptáků a papoušků.
Izolace a identifikace závisí na klasických postupech. Inkubace by vždy měla být prováděna za mikro-aerofilních podmínek protože některé kmeny rostou pouze za těchto podmínek při primární izolaci. Byla zaznamenána in situ hybridizace založená na cílení sondy na 16S rRNA. Sonda specificky detekuje Gallibacterium a ukázala se být užitečná při detekci Gallibacterium ve tkáních fixovaných formalínem.
Bakterin včetně biovarů 1, 2 a 4, který je zodpovědný za 95% ohnisek v Mexiku vyvinula firma Boehringer Ingelheim Vetmedica v Mexiku (Gonzales a kol., 2003; Vasques a kol., 2003).
Rod Volucribacter
Díky omezením a legislativním úpravám, které se týkají dovozu chycených divokých ptáků do Evropské Unie závisí zásobování rostoucího trhu s ptáky chovanými jako domácí mazlíčci na úspěchu šlechtitelských programů. Většina taxonů z čeledi Pasteurellaceae, které byly doposud prozkoumány se jeví jako komensálové na volně žijících hostitelích. Ale velká hustota a stísněné chovné prostory pro chov domácích ptáků v zajetí mohou změnit rovnováhu mezi hostitelem a parazitem za předpokladu, že existuje na mukózních membránách za normálních podmínek a mohou vyústit v onemocnění.
Zdá se, že většina členů čeledi Pasteurellaceae ztratila většinu genomové informace svých volně žijících předků během adaptace na obligátní parazitární život. Během tohoto procesu se také vyvíjela adaptace na hostitele a potenciál onemocnění pro hostitele. Ze stejných důvodů charakterizace Pasteurellaceae získaných z nemocí „nových hostitelů“ zahrnuje možnost, že se jedná o nové druhy. Charakterizace Pasteurellaceae z papouškovitých ptáků tak měla za následek popis nového taxonu 33 (Bisgaard a kol., 1999), který má souvislost s lézemi respiračního ústrojí a septikémií. Následná pozornost, která byla věnována existenci tohoto taxonu vedla k dalším 13 kmenům a finální klasifikaci taxonu 33 jako Volucribacter psittacida a Volucribacter amazonae (Christensen a kol., 2004b). Protože tyto organismy nebyly známé v ostatních laboratořích, izoláty bylo možné dosud získat pouze v Evropských zemích jako je Belgie, Německo a Dánsko.
Symptomy stejně jako léze spojené s těmito infekcemi jsou nespecifické a je třeba zdůraznit, že septické podmínky u papouškovitých ptáků způsobené těmito organismy mohou navíc k vaskulárním poruchám způsobovat mírně zduřelá játra a slezinu.
Metody a vlastnosti použité při identifikaci těchto organismů na úrovni rodu a druhu popsal Christensen a kol. (2004b).
Nepojmenované taxony Pasteurellaceae, které jsou důležité z veterinárního hlediska
Organismy, které byly získány z čisté kultury salpingitidy a peritonitidy u kachen byly nejprve označovány jako atypický Actinobacillus lignieresii (Bisgaard, 1975). Následné výzkumy dalších izolátů z kachen, hus a holubů klasifikovaly tyto organismy jako taxon 2 a taxon 3 (Bisgaard, 1982). Důležitost těchto mikroorganismů při salpingitidě vodních ptáků byla následně potvrzena Bisgaardem (1995a), který také rozšířil spektrum hostitelů a onemocnění u těchto mikroorganismů tak, že zahrnují koroptve, bažanty a papouškovité ptáky. AFLP typizace vybraných kmenů reprezentující existující biovary nedávno potvrdila dřívější profilování proteinů, výsledky DNA:DNA hybridizace a 16S rRNA sekvenční data což ukazuje, že tyto taxony představují nový rod Pasteurelaceae, který má souvislost s ptáky.
Originální publikace o taxonu 14 zahrnuje kmeny z lézí horního respiračního traktu kachen, krůt a holubů (Bisgaard a Mutters, 1986). Následné publikace rozšířily okruh hostitelů tak, že zahrnuje husy a pávy (Bisgaard, 1993) a bažanty (Christensen a kol., 2003b) a seskupily tyto organismy s taxonem 32 získaným z lézí respiračního traktu malých evropských a severoamerických sokolů a s taxonem 40 získaným z respiračního traktu racků (Christensen a kol., 2003b).
Závěrem můžeme říct, že tento přehled dokumentuje složitost a různorodost organismů klasifikovaných jako Pasteurellaceae. Budoucí výzkum by se měl zaměřit na bezpečnou bázi pro diagnostiku těchto organismů založenou na molekulárních metodách protože jednoznačná diagnóza je předpokladem pro lepší znalost a pochopení složitosti interakcí baktérie – hostitel a očekávané různorodosti virulenčních modelů těchto organismů. Ačkoliv jsou tyto mikroorganismy zodpovědné za některé z běžných a devastujících onemocnění u zvířat a ačkoliv jsou tyto infekce známé již desetiletí, mechanismus kolonizace, přežívání a množení a napadení hostitele zůstávají zcela nepochopeny a to ani nezmiňujeme virulenční faktory. Tradičně se považoval horní respirační trakt za přirozený habitat Pasteurellaceae, za prostředí, kde je menší zásobování živinami ve srovnání s gastrointestinálním traktem. Přirozená selekce v tomto prostředí pravděpodobně zvýhodnila vztah hostitel – baktérie což vedlo k určitému stupni hostitelské specifičnosti. Je třeba však ještě objasnit metabolickou schopnost těchto mikroorganismů ke komensalismu s hostitelem. Následný vývoj potenciálu onemocnění by také mohl záviset na komplikované interakci mezi baktérií a hostitelem. Do tohoto procesu je možná zapojeno mnoho genů, navíc k hostitelským faktorům. Z těchto důvodů by cílená nebo náhodná mutagneze mohla představovat obtížnou cestu vpřed. Zásadní práce o identifikaci povrchových proteinů a lipopolysacharidů na pozadí nedávno zaznamenané existence hostitelsky specifických klonů v rámci jednoho druhu s fylogenezí genů v pozadí by mohla vytvořit lepší základ pro následný výzkum a hledání faktorů virulence. Vývoj experimentálních modelů s cílením imunitních buněk do různých hostitelů s klony od odlišných živočišných druhů je také velmi žádoucí (Bojesen a kol., 2004a) stejně jako výzkumy týkající se metabolismu živin dostupných na povrchu mukózních membrán.
