L. Krkoška,1 M. Nebola,1 P. Šrenk,2 I. Steinhauserová1
1 Fakulta veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
2Veterinární klinika Jaggy, Brno
Veterinářství 2003;53:49-51
SOUHRN
Krkoška L., Nebola M., Šrenk P., Steinhauserová I. Využití metody PCR při identifikaci surovin živočišného původu v granulovaných krmivech pro psy a kočky. Veterinářství 2003;53:49-51.
K identifikaci živočišného druhu použitých surovin při výrobě granulovaných krmiv pro psy a kočky, byly aplikovány metody molekulární biologie k analýze DNA (multiplexní PCR, specifická PCR a PCR-RFLP). Z 20 testovaných vzorků u 8 neodpovídalo složení informacím deklarovaným na obalu výrobku. V testu lépe obstála krmiva z vyšší jakostní třídy i přes to, že deklarované složení bylo uvedeno podrobněji. Krmiva z nižší jakostní třídy vyhovovala hlavně z důvodu obecnější deklarace složení výrobku. Uvedený postup umožňuje kontrolu kvality výrobků a vyvíjí tlak na výrobce k dodržování receptur a technologické kázně.
Výživa domácích zvířat je jeden z nejdůležitějších faktorů, který má vliv na správný vývoj jak rostoucího organismu, tak dospělých zvířat. V Japonsku nebo Severní Americe jsou nutriční požadavky zvířat substituovány z více než 90 % komerčními krmivy. V Evropě je tato hodnota poněkud nižší, činí okolo 35 – 50 %.1 Rovněž na našem trhu je poměrně široká nabídka a spotřeba komerčních krmiv pro domácí zvířata neustále stoupá.
Komerční krmiva se z hlediska konzistence dělí do třech skupin: suchá, středně vlhká a vlhká. Tyto skupiny se liší výsledným obsahem vody po technologickém zpracování. Další členění lze provést např. podle zastoupení jednotlivých složek vytvářejících nutriční hodnotu. Hlavní složkou krmiv určených pro masožravce by měla být svalovina hospodářských zvířat a nebo v menší míře odpady pocházející z výroby masokombinátů. V poslední době byla zveřejněna jedna práce, která se zabývala hodnocením kvality komerčních krmiv. Hodnotí krmiva spíše ve vztahu k výživě kočky a zaměřuje se na určitá specifika tohoto masožravce. Autoři provedli chemický rozbor pěti krmiv, kde stanovili sušinu, N- látky, tuk, vlákninu, popel a minerální látky.2 Jiní autoři prováděli u testovaných krmiv mikrobiologickou a chemickou analýzu, kde monitorovali obsah tuku, N- látek, vitaminů, minerálií, přítomnost plísní, obsah sojové bílkoviny. Dále hodnotili v biologickém pokusu ochotu přijímat jednotlivé vzorky krmiv kontrolní skupinou zvířat. Testováním byla zjištěna přítomnost sojové bílkoviny, kterou výrobci nahrazují živočišnou bílkovinu. Některá krmiva by podle autorů dostatečně nepokryla energetickou potřebu zvířat, jelikož byl zjištěn nedostatek metabolizovatelné energie. U části vzorků byly zjištěny spory plísní. Z 15 testovaných vzorků byly pouze dva vyhodnoceny jako vyhovující.3 Žádná z těchto prací však netestovala krmiva na přítomnost proteinů s ohledem na jejich původ k živočišným druhům. Díky náročné technologii zpracování surovin jsou pro analýzu nevhodné metody využívající přímo detekci proteinů (ELISA apod.). Při vysokých teplotách a tlacích dochází k jejich destrukci a enzymatické metody tak mají omezené použití.
V našem sdělení uvádíme možnosti využití metod molekulární biologie, konkrétně metodu polymerázové řetězové reakce (PCR), k identifikaci živočišného druhu použité svaloviny při výrobě granulovaných krmiv. Tento typ analýzy se provádí především u potravin a jejich využití v oblasti krmiv se zaměřuje zejména na prevenci bovinní spongiformní encefalopatii.4 Cílem naší studie bylo ověřit, že i u svaloviny zpracované zvláštním technologickým postupem při výrobě granulovaných krmiv je možné určit její druhový původ a tím i nalézt možnosti prověření technologické kázně výrobců, tj. dodržování receptury, použití surovin uvedených na obalu apod. Chovatel při výživě svého zvířete předloženým informacím věří a spoléhá se, že poskytuje zvířeti dostatečně kvalitní krmení. Serióznost informací výrobců je rovněž velice důležitá i pro veterinární lékaře, kteří používají speciální klinické diety při onemocněních nejrůznějšího charakteru.
Materiál a metodika
V naší studii bylo laboratorně testováno 20 komerčních granulovaných krmiv. Vzorky byly získány nákupem ve specializovaných prodejnách a od privátních veterinárních lékařů, kteří ve své praxi využívají speciální, komerčně dostupná dietetická krmiva. Vzorky byly uloženy do anonymních vzorkovnic, označeny číslem a skladovány při laboratorní teplotě.
Před vlastní analýzou bylo nutné získat ze vzorků DNA k provedení PCR. Vedle klasické metody izolace organickými rozpouštedly5 se osvědčily některé komerční soupravy jejichž použitím bylo získáno dostatečné množství DNA o vhodné kvalitě. Podle naších zkušeností se nejvíce osvědčil komerční kit pracující na principu sorpční membrány, kam se DNA naváže, zatímco ostatní nečistoty v podobě proteinů jsou spolehlivě odstraněny. Takto získaná templátová DNA byla dále použita do vlastní polymerázové řetězové reakce.
Principem PCR je pomnožení krátkého úseku cílové DNA vymezeného primery, jehož sekvence je specifická pro určitý živočišný druh. V některých případech je délka takto získaného produktu charakteristická, v jiných případech je nutné analyzovat rozdíly v sekvenci pomocí speciálních restrikčních enzymů, které rozštěpí produkt PCR na přesně definované fragmenty (analýza délky restrikčních fragmentů - RFLP). Jejich délku lze stanovit na základě elektroforetického rozdělení v agarózovém gelu a srovnáním se standardem molekulové hmotnosti. Vizualizace produktů PCR je možná po obarvení ethidium bromidem v UV světle na transluminátoru. Na základě těchto testů lze pak stanovit DNA různých živočišných druhů přítomných ve vzorku a tím de facto určit původ použité suroviny při výrobě daného krmiva.
Pro základní orientaci o složení vzorku je výhodné využít tzv. multiplexní PCR, která odhalí přítomnost několika živočišných druhů současně jednou reakcí (prase, skot, kůň, kuře, ovce), čímž se podstatně zjednoduší a urychlí celá analýza.6 Při multiplexní PCR je nutno použít kombinaci primerů tak, aby amplifikované části DNA jednotlivých zvířat bylo možné rozlišit elektroforeticky. Pro jiné živočišné druhy, které multiplexní PCR neodliší, bylo nutno zavést další PCR protokoly: specifická PCR, kdy k amplifikaci dochází pouze v přítomnosti templátové DNA daného živočišného druhu, zatímco u DNA jiných zvířat k syntéze nedochází (krůta),7 nebo kombinace PCR-RFLP (losos, koza, ovce).8,9
Výsledky
U všech testovaných vzorků byla nejdříve použita multiplexní PCR detekující přítomnost DNA (a tím i surovin) od 5 druhů zvířat: kuře, prase, skot, ovce a kůň. Po testování multiplexní PCR byly vzorky analyzovány specifickou PCR a nebo PCR s následným restrikčním štěpením získaných produktů PCR (PCR-RFLP).
Při vyhodnocování jsme vždy vycházeli z informací, které výrobce uvedl na obalu. Z 20 analyzovaných krmiv nevyhovělo celkem 8 vzorků. Do skupiny nevyhovujících byla zařazena ta krmiva, u kterých byl identifikován protein neuvedený na obalu. Za nevyhovující jsme považovali rovněž krmiva, která měla na obalu deklaraci určitého proteinu, ovšem ten zjištěn nebyl. Pochopitelně v testu obstála velmi dobře krmiva, která uvádějí ve výčtu ingrediencí obecné informace „maso a produkty živočišného původu“. Pod tímto pojmem lze chápat prakticky cokoli, co pochází z těl hospodářských zvířat.
Diskuse
Někteří výrobci používají jako zdroj bílkovin místo svaloviny masovou nebo masokostní moučku. Vstupní surovina tedy při výrobě granulí již projde tepelným opracováním v kafilériích (teplota 133 °C při tlaku 3 bary po dobu 20 minut). Druhé tepelné opracování čeká již hotovou směs podle příslušné receptury v extrudorech (100 – 200 °C při tlaku 36,5 barů).1 Proteiny při těchto teplotách a tlacích již dávno ztrácejí svou původní strukturu a tedy jejich využitelnost pro stanovení metodou ELISA je omezená. Z našich výsledků je zřejmé, že použitá metoda DNA analýzy je pro druhovou identifikaci vhodná, dokáže zachytit více druhů DNA najednou, i když ne každá druhově specifická DNA je zastoupena ve stejné míře. Kvalitativní záchyt je naprosto specifický. To, že lze ještě získat DNA v takovém stavu, aby bylo možno amplifikovat templátovou DNA metodou PCR činí z molekuly DNA exkluzivní biologický marker. Během technologického zpracování dochází k určitému úbytku DNA ze vzorku. Tento úbytek nemá vliv na specifitu a spolehlivost stanovení. Další předností použité metody je její vysoká citlivost. V naší laboratoři byla jako hranice citlivosti stanovena hodnota 10 pg templátové DNA. Jako čistě teoretickou úvahu lze uvést, že PCR je schopna amplifikovat pouze jednu molekulu templátové DNA. Zde je nutno podotknout, že tato obrovská citlivost může také způsobit falešnou pozitivitu. Proto je nezbytné paralelně se stanovením provádět negativní kontrolu, aby se případná kontaminace cizorodou DNA vyloučila.
Po analýze DNA metodou PCR a PCR-RFLP je zřejmé, že krmiva často obsahují směs více druhů živočišných proteinů. Existují případy, kdy se v jednom krmivu objeví i čtyři proteiny různého původu. Na našem trhu lze zakoupit krmiva od tří kategorií výrobců. V první kategorii jsou krmiva superpremium, kde výrobce ručí za vysokou kvalitu svého produktu, na obalu je přesně deklarované složení s přesným výčtem ingrediencí. Tito výrobci provádějí výzkum v oblasti výživy malých zvířat a získané výsledky publikují ve vědeckých časopisech. V druhé kategorii jsou krmiva střední třídy a ve třetí pak tzv. nízká kvalita. Sem patří většina výrobců krmiv na našem trhu, která nemají již tak vysoké kvalitativní znaky. Ze získaného souboru 20 vzorků do první skupiny patřilo 5 a do druhé a třetí 15 vzorků. Po srovnání výsledků s informacemi na obalu byl ze skupiny první označen jako nevyhovující jeden vzorek, ze skupiny druhé to bylo 7 vzorků. Samozřejmě třída superpremium krmiv je z hlediska detailního zápisu v ingredienční listině mírně znevýhodněna, jelikož lze provést konkrétní kontrolu každého udávaného proteinu. Naproti tomu krmiva ve střední a nižší třídě díky své „volné“, obecné deklaraci mají situaci ulehčenu, neboť samotný záchyt jakéhokoliv živočišného proteinu splňuje požadavek takovéto deklarace. Tato deklarovaná technologická volnost však může být orientačním ukazatelem kvality daného produktu. V tomto případě se lze jen dohadovat, co má vlastně takové krmivo obsahovat a na co je určeno. Jelikož se nelze opřít o žádné konkrétní informace, je nutno tyto vzorky kvalifikovat jako vyhovující. Z hlediska zákazníka je to ovšem zavádějící a nejméně vhodný způsob označení. V jednom případě bylo krmivo označeno ,,lamb and rice“ (skopové a rýže), ale ve výčtu ingrediencí nebylo skopové maso vůbec uvedeno, namísto toho bylo uvedeno pouze maso a výrobky živočišného původu. Analýzou DNA bylo prokázáno jak maso jiného původu, tak maso skopové. Proto byl z důvodu obecné deklarace tento výrobek zařazen do skupiny vyhovujících, i když se informace na obalu rozcházely. Jiný výrobek například měl obsahovat pouze lososí maso. Výsledek testu však prokázal ještě přítomnost krůtí DNA, což svádí k myšlence, že výrobce se pokusil nahradit část dražší vstupní suroviny levnější náhražkou a tím zachovat biologickou hodnotu.
Možnosti stanovení jednotlivých živočišných proteinů umožňuje provádět kontrolu výrobců. Otevírá se možnost odlišit solidního výrobce od ostatních a tím zvýšit tlak na kvalitu prodávaných krmiv na trhu. To se samozřejmě odrazí na celkovém zdravotním stavu a celkové vitalitě zvířat.
Zcela zvláštní postavení mají veterinární diety, jejichž proteinové složení má klíčový význam pro zdraví zvířat. Dají se sem zařadit diety s medicínským významem pro prevenci nebo léčbu metabolických chorob. Tzv. hypoalergenní dieta má nezastupitelné místo v diagnostice a léčbě intolerancí a hypersenzitivit pocházejících z potravy. Nejčastěji dochází k manifestaci na gastrointestinálním traktu a kůži, přičemž není jednoduché určit na jakou složku potravy je zvíře citlivé. Jediným možným průkazem těchto onemocnění je eliminační a provokační test. Nejčastější alergeny u koček jsou uváděny proteiny kravského mléka, hovězí a rybí maso. Pro psa může být potenciální alergen v podobě hovězího, vepřového, drůbežího a koňského masa. Jako vhodná hypoalergenní dieta je krmivo pouze s jedním proteinem a jedním sacharidem. Klade se důraz na vysokou kvalitu, stravitelnost (min. 87 %) a biologickou hodnotu. Tyto diety mají význam pouze v případě, že obsahují přesně to, co je uvedeno na obalu. V opačném případě se veterinární lékař dostane do slepé uličky. Zcela opačná je situace např. při onemocnění jater s projevy hepatoencefalopatie, kdy se autoři shodují, že je maso kontraindikováno v důsledku nebezpečí intoxikace CNS produkty bílkovinného metabolismu. V tomto případě je nutné protein v podobě masa nahradit bílkovinou mléčnou nebo rostlinnou. Další opodstatnění hypoalergenních diet je při zánětech GIT. Vhodné je podávat krmení s netradičním druhem masa (králík, krůta, jehně, kůň), aby se díky zvýšené propustnosti střevní bariéry nevyvinula v pozdější době hypersenzitivita, která znemožní příjem masa z daného druhu zvířete.9 V našem testu bylo hodnoceno 5 vzorků těchto veterinárních diet a jeden byl zařazen do kategorie nevyhovujících. Tento počet vzorků je pro statistické vyhodnocení nedostatečný, ale zdůrazňuje nutnost kontroly krmiv na všech kvalitativních úrovních.
Závěr
Závěrem se dá konstatovat, že analýza DNA umožňuje testovat i granulovaná krmiva vyrobená za extrémních fyzikálních podmínek. Ukázalo se, že molekula DNA je schopna si zachovat své charakteristické vlastnosti i po takových technologických procesech a je možné ji použít k uvedeným analýzám. Na základě předkládaných výsledků lze doporučit, aby byla používána, pokud je to možné, krmiva a zejména zvláštní diety od renomovaných firem. Tyto firmy ručí za kvalitu důslednou přípravou receptur a dokonalou technologickou kázní a zaručují pouze produkty s vysokým standardem. Podrobné informace na obalu poskytují několik výhod: a) kupující má možnost zjistit přesné složení, b) umožňují přímou kontrolu výrobců, kteří se tím zavazují k vyšší kvalitě, c) u krmiv s obecnou deklarací živočišného proteinu lze kontrolovat změny v receptuře, právě u zdrojů živočišných proteinů, v určitých časových intervalech.
Práce vznikla za podpory grantů FR 220021 MŠMT a IGA 210001 VFU Brno.
Literatura:
1. Hand S. M., Thatcher D. C., Remillard L. R., Roudebush P. Small Animal Clinical Nutrition. Mark Morris Institute, Topeka, Kansas, USA, 2000:127-161.
2. Huml O., Sedláčková L. Naše zkušenosti s krmivy pro psy a kočky. In: Sborník X. výroční konference ČAVLMZ. Hradec Králové, 2002:39-44.
3. Suchý P. Osobní sdělení, 2002.
4. Kingombe C. I. B., Lüthi E., Schlosser H., Howald D., Kuhn M., Jemmi T. A PCR- based test for species-specific determination of heat treatment conditions of anilmal meals as an effective prophylactic method for bovine spongiform encepahlopathy. Meat Science 2001; 57: 35-41.
5. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory manual. New York, USA; Cold Spring Harbor Laboratory Pres, 1989: 9.16 –9.23.
6. Matsunaga T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Shibata K., Yamada J., Shinmura Y. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Science 1999; 51:143-148.
7. Lockley A. K., Bardsley R. G. Intron variability in an actin gene can be used to discriminate between chicken and turkey DNA. Meat Science 2002;61:163-168.
8. Partis L., Croan D., Guo Z., Clark R., Coldham T., Murby J. Evaluation of a DNA fingerprinting method for determining the spacies origin of meats. Meat Science 2000;54:369-376.
9. Chikuni K., Tabata T., Kosugiyama M., Monma M. Polymerase chain reaction assay for detection of sheep and goat meats. Meat Science 1994;37:337-345.
10. Svoboda M., Senior D. F., Doubek J., Klimeš J. Nemoci psa a kočky 1 díl. Brno; Noviko ČAVLMZ, 2000: 659-944.
Adresa autora:
MVDr. Leoš Krkoška
Ústav hygieny a technologie masa
Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Palackého 1 - 3
612 42 Brno
Kompletní text včetně obrazového materiálu naleznete ve Veterinářství 2003;53:49-51.
