Erik Teske, DVM, PhD, Dip ECVIM-CA
Utrecht University, The Netherlands
Indikace a technika
Ve veterinární medicíně je zájem o techniku cytologického vyšetření preparátů získaných aspirační biopsií poměrně nedávného data. Z toho by bylo možné usuzovat, že se jedná o metodu vyvinutou v poslední době, avšak opak je pravdou. Už v r. 1851 švýcarský patolog H. Lebert popsal metodu diagnostické aspirace ve své knize „Traité des Maladies cancéreuses et des Affections curables confondues avec le Cancer: („... a explorativní aspirace může odstranit veškeré pochybnosti. Jde-li o purulentní nebo serózní cystu, vytéká z jehly proud tekutiny; je-li punktována nádorová tkáň, bude jehla obklopena pevnějšími strukturami a je méně pohyblivá. Získáme-li nějaký materiál, je to řídká hmota, která se při makroskopickém a v případě potřeby mikroskopickém posouzení jeví jako nádor.“) O několik let dříve (1838) berlínský fyziolog Johannes Muller poprvé popsal cytologická kritéria pro odlišení benigních a maligních nádorů. Nyní, téměř po 150 letech, se tato metoda stala populární i ve veterinární medicíně.
V této kapitole budou popsány indikace a technika „tenkojehlové aspirační biopsie“ (Fine Needle Aspiration Biopsy, FNAB). Budou zmíněny i další metody získávání materiálu pro cytologické vyšetření. Cytologické diagnózy budou použity jen jako příklady. V další kapitole bude popsáno cytologické vyšetřování nátěrů. V seznamu literatury jsou uvedeny kvalitní příručky zabývající se touto tématikou.
Výhody a nevýhody FNAB
Cytologické vyšetření nátěrů získaných FNAB má několik nevýhod oproti histologickému vyšetření bioptátů, ale jsou zde i různé výhody. Ty by měly být pečlivě zvažovány při rozhodování, zda provést chirurgickou biopsii pro histologické vyšetření nebo aspirační biopsii.
Pozitivní vypovídací hodnota cytologie je vyšší než negativní vypovídací hodnota. Jinými slovy, absence maligních buněk v cytologickém preparátu je méně spolehlivá než přítomnost nádorových buněk. Aspirační jehla může být bohužel zavedena mimo nádor nebo do nekrotické či zánětlivě změněné části nádoru, nebo se nádor může skládat z buněk, které nelze snadno aspirovat. Všechny tyto okolnosti mohou vést k falešně negativním výsledkům s ohledem na nádor. Další limitací FNAB je nemožnost studovat histologickou strukturu lézí.
Atraktivita FNAB spočívá ovšem v jejích přednostech. Je to metoda, které se lze snadno naučit. Je levná a rychlá a výsledky mohou být známy již během půl hodiny. FNAB lze provádět bez anestézie v průběhu klinického vyšetření. Nátěry nemusí být zpracovány ihned, ale mohou být ponechány na pozdější dobu. Pomocí FNAB můžeme získávat vzorky z jednoho procesu opakovaně, což je výhodné při sledování pacienta v průběhu léčby. Riziko metastáz vyprovokovaných FNAB je zanedbatelné.
Indikace pro provedení FNAB
Na základě cytologického vyšetření bioptátů získaných pomocí FNAB je obvykle možné odlišit zánět od nádoru, akutní zánět od chronického, benigní nádor od maligního. Lze rozpoznat etiologická agens řady infekčních zánětů (bakterie, houby, parazité jako toxoplasma a leishmania) a lze provést další klasifikaci mnoha tumorů. Kožní a podkožní útvary, které nelze blíže specifikovat na základě klinického vyšetření, představují výbornou indikaci pro aspirační biopsii. Pomocí FNAB je možno klasifikovat většinu kožních nádorů (např. mastocytom, histiocytom, karcinom skvamózních buněk, bazaliom, melanom). Naproti tomu v případě mezenchymální proliferace je často obtížné určit, zda se jedná o tumor nebo chronický zánět a rovněž malignita a typ nádoru (fibrosarkom, hemangiopericytom, hemangiosarkom) jsou obvykle nejisté. Často nedospějeme dále než k diagnóze „mezenchymální proliferace“. Rovněž tumory mléčné žlázy, zejména pro nezkušeného cytologa, mohou představovat problém, neboť stimulovaná mamární tkáň často obsahuje atypické buňky. Naproti tomu různé abnormality mízních uzlin (včetně metastáz) jsou snadno diagnostikovatelné. Pro ty, kdo mají zkušenosti s technikou biopsií, se nabízejí další indikace FNAB: změny prostaty, intersticiální změny v plicích, klinické podezření na abnormality jater nebo sleziny. U těchto indikací je však vyšší riziko komplikací. Zejména perkutánní biopsie plic by neměly být prováděny, pokud nejsme schopni zvládnout eventuální komplikace.
Technika FNAB
Materiál potřebný pro provedení FNAB je velmi jednoduchý: několik podložních sklíček s matovou plochou na jednom konci, 10 ml jednorázová stříkačka a tenká (G 22) jehla.
Je důležité používat sklíčka pro mikroskopii s matovou ploškou, abychom je mohli označit olověnou tužkou. Zejména při odběru četných bioptátů může být záměna sklíček velmi nepříjemná (pro vás i vašeho pacienta). Pravděpodobnost záměny se zvyšuje, pokud mikroskopické vyšetření neprovádíme sami a zasíláme preparáty další osobě. Nejlepší způsob označování je olověnou tužkou, neboť na rozdíl od inkoustu se nerozpustí v alkoholu během barvení.
V humánní medicíně existují držáky na stříkačky pro aspirační biopsii. Obvykle je nutno použít 20 ml stříkačku, která je dražší a podle našich zkušeností je mnohem méně snadné s ní manipulovat. Vzdálenost od pacienta je příliš velká, což u neklidných zvířat může být nevýhodou. Nedostatkem malé stříkačky je, že píst musíme povytáhnout více, abychom vytvořili dostatečné vakuum. Stříkačka 10 ml se jeví jako vhodný kompromis.
Je mylné se domnívat, že silnější jehlou získáme lepší aspiráty. Silnou jehlou nasajeme velké kusy tkáně. Je obtížné je pak rozetřít, snadno se poškodí, těžko se barví a vyšetřují. Navíc snadněji aspirujeme krev. Zkušenosti ukázaly, že jehla velikosti G 22 dává nejlepší výsledky. Jen nelze-li touto jehlou získat žádný materiál, stojí za pokus použít o něco silnější jehlu.
Anestézie je jen zřídka potřebná, a to i při biopsiích na hlavě a končetinách, kde aspirace může být někdy bolestivá. Pacient musí být přiměřeně fixován majitelem nebo asistentem. Po ostříhání srsti a desinfekci fixujeme útvar jednou rukou a druhou rukou zavádíme jehlu nasazenou na stříkačce. Vakuum 1 - 2 ml je pro aspiraci materiálu obvykle dostačující. Jehlou pohybujeme v různých směrech, abychom získali co nejreprezentativnější bioptát, a to tak, že ji nevytahujeme z útvaru. Často nevidíme v konusu jehly žádný materiál nebo je ho velmi malé množství. Jestliže náhle nasajeme krev, je lépe vzít novou stříkačku a jehlu a začít znovu, neboť větší množství krve znemožní posouzení preparátu. Než jehlu zcela vytáhneme z tkáně, zrušíme vakuum tak, že necháme píst, aby se vrátil do výchozí polohy. Jinak se aspirovaný materiál ocitne ve stříkačce a pak je velmi obtížné jej dostat ven. Poté sejmeme jehlu, do stříkačky nasajeme vzduch, jehlu znovu pevně nasadíme na stříkačku a obsah jehly vystříkneme na sklíčko.
Byla popsána řada metod, jak rozetřít bioptovaný materiál. Můžeme jemně přiložit druhé sklíčko na podložní a krouživým pohybem je od sebe opět odtáhnout, čímž se vzorek rozprostře do tenké vrstvy. Používá se i roztěr materiálu jehlou nebo čepelí skalpelu. Tímto způsobem se však často zničí mnoho buněk. K tomu nedojde, pokud použijeme stejný postup jako při roztěru kapky krve. K podložnímu sklíčku přiložíme další pod úhlem 45° tak, aby se materiál roztekl podél jeho hrany a plynulým tahem (materiál je tažen za sklíčkem) jej rozetřeme po podložním sklíčku. Doporučuje se odebrat větší počet aspirátů z každého nádoru. Je-li tumor velký, odebíráme vzorek ze středu i z okraje. Tak zvýšíme šanci na získání reprezentativního vzorku. Na periferii tumoru je menší šance získat buňky, ale správně získaný aspirát je zde reprezentativnější, neboť rychle rostoucí nádory v centru nekrotizují. Totéž platí o mízních uzlinách invadovaných nádorem. Při generalizované lymfadenopatii se doporučuje bioptovat více uzlin, neboť ty mohou někdy nekrotizovat do té míry, že to znemožní správné vyhodnocení vzorku. Mandibulární mízní uzlina se jeví jako méně vhodná pro cytologické vyšetření, protože je obvykle reaktivní v důsledku nevýznamných zánětů v dutině ústní. To pak může maskovat pravou příčinu lymfadenopatie.
Exfoliativní cytologie
Kromě FNAB útvarů nebo tkání můžeme získat cytologické otisky z povrchových lézí pomocí některé z následujících metod.
a) Otisky
Otisky můžeme pořídit z kožních lézí jako jsou vředy, exsudativní dermatitis a z chirurgicky excidovaného materiálu. Otisky z kožních lézí lze získat tlakem sklíčka na lézi. Můžeme zvážit i „oživení“ léze seškrabem pomocí skalpelu. Z chirurgicky excidovaného materiálu pořídíme otisky nejlépe tak, že provedeme čerstvý řez, gázou odsajeme z povrchu krev a pak zatlačíme sklíčkem na lézi. Vždy se vyplatí zhotovit několik otisků. Jestliže v otiscích je málo buněk, sterilním skalpelem seškrabujeme povrch tkáně, až nějaký materiál ulpí na čepeli. Pak jej přeneseme na sklíčko.
b) Stěry
Léze např. v uchu nebo v nose, ale i na kůži, můžeme setřít vatovým tampónem. Materiál pak ihned přeneseme na sklíčko, aby nestačil zaschnout.
c) Přímé otisky
Přímé otisky Z povrchových lézí nebo kožních lézí s vesikulami, pustulami aj. snadno získáme vzorky seškrabem pomocí skalpelu a přenesením na sklíčko. V případě vesikul a pustul je lépe otevřít lézi sterilním skalpelem nebo injekční jehlou a získat obsah nebo otisknout na sklíčko vnitřní stranu vypouklé části eflorescence.
Zpracování preparátů
Po zhotovení nátěru je pro další zpracování preparátu rozhodující, pro jakou metodu barvení se rozhodneme. Při barvení dle Papanicolaoua musíme preparát ihned fixovat (fixačním sprejem nebo ponořením sklíčka do alkoholu). Při barvení dle Romanowského (Giemsa, May-Grünwald Giemsa, Hemacolor, DifQuick) je před barvením nezbytná fixace sušením na vzduchu. Suché preparáty lze pak delší dobu uchovávat, než je obarvíme. Při tomto barvení není přípustná fixace sprejem, alkoholem, zahřátím ani formalínem. Nátěr nesmíme přikrýt dalším sklíčkem!
Jak je uvedeno dále, existují různé barvicí postupy (tabulka 1-1) Barvení dle Papanicolaoua (tabulka 1-2) je velmi pracné a zdlouhavé. Jeho výhodou je, že poskytuje jasné detaily struktury jádra. Zobrazí také dobře stupeň keratinizace buněk. Naproti tomu často obarví velmi nedostatečně nebo vůbec cytoplazmatické granule. Barvení dle Romanowského (tabulka 1-3, 1-4) je podle literatury i našich zkušeností pro veterinární medicínu vhodnější. Je vhodné pro znázornění cytoplazmatických inkluzí a mikroorganismů. Kromě těchto přehledných barvení existují různá speciální barvení. Příkladem je barvení rubeanovou kyselinou znázorňující měď (např. v hepatocytech). Tyto postupy najdeme v příslušné literatuře.
Jestliže vzorky sami nevyšetřujeme, raději je ani nebarvíme, protože každý cytolog je zvyklý na vlastní postupy. V tom případě preparáty usušené na vzduchu posíláme ve vhodných plastikových obalech na sklíčka spolu se stručným popisem pacienta, anamnézy, typu a lokalizace biopsie a dalších klinických informací.
Tabulka 1-1.
Barvicí metoda Počet misek Doba barvení
Papanicolaou 24 35 min
May-Grünwald Giemsa 3 22 min
Hemacolor® (Merck) 3 0,5 min
Tabulka 1-2. Metoda dle Papanicolaoua
1. alkohol 70% 20 sec 13. alkohol 80% 20 sec
2. alkohol 50% 20 sec 14. alkohol 96% 20 sec
3. destilovaná voda 20 sec 15. Oranž G 3 min
4. Harrisův hematoxylin 6 min 16. alkohol 96% 20 sec
5. destilovaná voda 20 sec 17. alkohol 96% 20 sec
6. 0.25% HCl 3 pon.* 18. EA 50 5 min
7. voda z vodovodu 20 sec 19. alkohol 96% 20 sec
8. lithium karbonát 1 min 19. alkohol 96% 20 sec
9. voda z vodovodu 20 sec 21. alkohol 96% 20 sec
10. destilovaná voda 20 sec 22. alkohol 100% 20 sec
11. alkohol 50% 20 sec 23. xylol 5 pon.*
12. alkohol 70% 20 sec 24. xylol 15 min
*pon. = ponoření
Tabulka 1-3. May-Grünwald Giemsa method
Roztok 1: methyl alkohol 90% 5 min
Roztok 2: May-Grünwald 1 díl, fosfátový pufr pH 6.98 1 díl 4 min
Roztok 3: Giemsa 1 díl, fosfátový pufr pH 6.98 9 dílů 15 min
Tabulka 1-4. Hemacolor Roztok
Roztok 1: 5x 1 sec
Roztok 2: 3x 1 sec
Roztok 3: 6x 1 sec
Opláchnout pufr. roztokem pH 7.2
Literatura
- Boon GD, Rebar AH, DeNicola DB. A cytologic comparison of Romanowsky stains and Papanicolaou-type stains. I. Introduction, methodology and cytology of normal tissues. Vet Clin Pathol 11:22-30, 1982.
- Cowell RL, Tyler RD. Diagnostic Cytology of the Dog and Cat. American Veterinary Publications, Inc., Goleta, California, 1989.
- Grunz H, Spriggs AI. History of Clinical Cytology. A selection of documents. 2nd ed. G-I-T Verlag Ernst Giebler, Darmstadt, West Germany, 1983.
- Perman V. Alsaker RD, Riis RC. Cytology of the Dog and Cat. Am Anim Hosp Assoc, South Bend, Indiana, 1979.
- Rebar AH. Handbook of Veterinary Cytology. Ralston Purina Company, St. Louis, Missouri, 1979.
