Možnosti intravitální diagnostiky scrapie imunohistochemickým vyšetřením lymfatických tkání

F. KOSTKA, O. VÁVRA
Státní veterinární ústav Jihlava
Veterinářství 2002;52:401-402

SOUHRN
Kostka F., Vávra O. Možnosti intravitální diagnostiky scrapie imunohistochemickým vyšetřením lymfatických tkání. Veterinářství 2002;52:401-402.
Příspěvek stručně shrnuje možnosti laboratorní diagnostiky scrapie se zvláštním zřetelem na intravitální diagnostiku tohoto onemocnění. Jsou uvedeny výsledky imunohistochemického vyšetření lymfatické tkáně ovcí nemocných scrapie, jež bylo prováděno na pracovišti patologie SVÚ Jihlava, a jeho porovnání se zahraničními studiemi. Zavedená metodika se jeví jako vhodná pro indikované vyšetření jednotlivých ovcí a umožňuje odhalení nemocných zvířat v inkubační době onemocnění, před nástupem typických klinických příznaků.

SUMMARY
Kostka F., Vávra O. Intravital diagnosis of scrapie achieved by immunohistochemistry of lymphatic tissue. Veterinářství 2002;52:401-402.
The report briefly summarizes up-to-date knowledge of basic diagnostic procedures for scrapie – basicly focussed on clinical and laboratory methods. Results of immunohistochemistry of the lymphatic tissue obtained by referral laboratory of the SVU Jihlava are being presented and then compared to the results of the studies conducted and published abroad. The method used in this study appears to be sufficient enough for routine examination of the individual sheep, sensitive to disclose the disease before a typical clinical signs will come up.

Scrapie je fatální neurodegenerativní onemocnění ovcí a koz s extrémně dlouhou inkubační dobou, charakterizované akumulací patologické izoformy prionového proteinu (PrP^Sc) ve tkáních postiženého organismu.^Sc Predilekčním místem akumulace PrP^Sc je centrální nervový systém, což vede k rozvoji typických příznaků onemocnění CNS. PrP^Sc nevyvolává u postiženého organismu tvorbu specifických protilátek, není proto možná intravitální sérologická diagnostika scrapie.
V současnosti používané laboratorní metody pro diagnostiku scrapie jsou založeny na postmortálním vyšetření tkáně centrálního nervového systému. Scrapie lze diagnostikovat histopatologickým či imunohistochemickým vyšetřením CNS nebo detekcí PrP^Sc pomocí některého z rychlých testů (Western-blot, ELISA), případně elektronmikroskopickým průkazem PrP^Sc (SAF – Scrapie Associated Fibrils). Použití těchto vyšetřovacích metod je možné pouze po předchozím utracení či poražení vyšetřovaného zvířete nebo po jeho úhynu.
PrP^Sc lze však detekovat také v některých tkáních lymfatického systému postiženého zvířete, a to měsíce až roky před rozvojem klinických příznaků onemocnění.^1-3 Právě detekce PrP^Sc v těchto tkáních je základem intravitálního testování zvířat na onemocnění scrapie.

Materiál a metodika
Vzhledem k prokázanému konstantnímu výskytu PrP^Sc v lymfatických tkáních (tonsily, retrofaryngeální, mandibulární a mezenteriální mízní uzliny, lymfatická tkáň třetího víčka) lze těchto tkání využít pro intravitální průkaz PrP^Sc modifikovanou metodou imunohistochemického vyšetření.⁴ Jedná se o vysoce specifickou vyšetřovací metodu, založenou na detekci PrP^Sc ve tkáňových řezech vazbou monoklonálních protilátek na PrP^Sc s následnou vizualizací této specifické vazby chromogenem.⁵
Nejvhodnějším vzorkem pro vyšetření na scrapii je lymfatická tkáň třetího víčka, protože je snadno přístupná pro rutinní odběr. Pro přesné posouzení vyšetřovaného materiálu je nezbytná přítomnost alespoň šesti lymfatických folikulů v odebraném vzorku, při menším počtu nelze v některých případech vyslovit konečnou diagnózu.² Lymfatická tkáň se nachází na vnitřním povrchu třetího víčka v podobě shluku drobných uzlíků. Odběr lze provádět při lokálním znecitlivění oční spojivky, někdy je nutná sedace zvířete. Lymfatická tkáň se odstřihne ostrými očními nůžkami a fixuje v 10% pufrovaném formaldehydu, nejlépe napnutá na čtverečku papíru. Po 24 - 48hodinové fixaci je možno přistoupit k vlastnímu vyšetření.
Při vyšetření se využívá běžná histologická parafinová technika. Řezy na podložních sklíčkách se nejprve inkubují s primární protilátkou myšího původu (F89 a F99) proti prionovému proteinu a v dalších krocích se inkubují se sekundární anti-myší protilátkou a nakonec s chromogenem.⁶ Následuje kontrastní dobarvení řezů hematoxylinem nebo malachitovou zelení.

Vlastní ověřování
Počátkem roku 2002 byla na pracovišti patologie SVÚ Jihlava ověřena a zavedena metodika vyšetření lymfatické tkáně třetího víčka na přítomnost PrP^Sc. K ověření metody jsme použili lymfatickou tkáň třetího víčka z pěti kusů ovcí plemene Texel pozitivně testovaných na scrapie metodou Western-blot a imunohistochemickým vyšetřením CNS. Jako negativní kontrola sloužil stejný materiál z pěti poražených ovcí starších 18 měsíců, které jsme v rámci běžného monitoringu negativně vyšetřili na scrapie testem Western-blot. Pro vlastní zpracování vzorků jsme využili komerční set firmy VMRD, Inc., určený pro imunohistochemickou diagnostiku prionových onemocnění. Po technickém zvládnutí náročného pracovního postupu byla v našem případě stoprocentní záchytnost u pozitivních kusů.
V místě lokalizace PrP^Sc ve vyšetřovaném vzorku lymfatické tkáně byla patrná barevná reakce, a to v cytoplazmě lymfocytů i v mezibuněčných prostorech, kde se soustředila především v centru lymfatických folikulů. V případě absence PrP^Sc ve vyšetřované tkáni nebyla barevná reakce patrná, tkáň byla uniformně kontrastně zbarvena.

Diskuse a závěr
Imunohistochemická metoda intravitální diagnotiky scrapie je i přes svou náročnost (odběr materiálu, pracnost, nákladnost) v indikovaných případech metodou použitelnou a vhodnou. V literatuře je uváděna minimální senzitivita testu 87 % se specifitou 94 %.² Citlivost vyšetření je ovlivněna především stupněm pokročilosti onemocnění a je nižší u nemocných zvířat, jež zatím neprojevují klinické příznaky onemocnění. Naopak u klinicky nemocných zvířat je citlivost testu až 99 %.²
Metoda je vhodná pro vyšetření chovatelsky cenných zvířat nebo zvířat s nespecifickými příznaky onemocnění CNS či s prokázanou genetickou vnímavostí ke scrapie, dále importovaných zvířat a kusů ze stád s potvrzeným výskytem scrapie, bez nutnosti utrácení těchto jedinců. Vyšetřením chovných bahnic je možno zabránit pozdějšímu zamoření prostředí původcem scrapie obsaženým v plodových obalech.
Metoda však není určena k hromadnému testování vnímavých zvířat jako náhrada za současně používané rychlé metody postmortálního vyšetření.

Literatura:
1. O´Rourke K. I., Baszler T. V., Parish S. M. et al. Preclinical detection of PrP-Sc in nicticating membrane lymphoid tissue of sheep. Vet Rec 1998;141:489-491.
2. O´Rourke K. I., Baszler T. V., Besser T. E. et al. Preclinical Diagnosis of Scrapie by Immunohistochemistry of Third Eyelid Lymphoid Tissue. J Clin Microbio 2000;38:3254-3259.
3. Muramatsu Y., Onodera A., Horiuchi M. et al. Detection of PrPSc in sheep at the preclinical stage of scrapie and its significance for diagnosis of insidious infection. Arch Virol 1994;134:3-4.
4. Ikegami Y., Ito M., Isomura H. et al. Pre-clinical diagnosis of scrapie by detection of PrP protein in tissues of sheep. Vet Rec 1991;128:271-275.
5. Kim H., O´Rourke K. I., Walter M. H., Purchase G., Enck J., Shin T. K. Immunohistochemical detection of scrapie prion proteins in clinically normal sheep in Pennsylvania. J Vet Diagn Invest 2001;13:89-91.
6. O´Rourke K. I., Baszler T. V., Miller J. M. et al. Monoclonal antibody F89/160.1.5. Defines a Conserved Epitope on the Ruminant Prion Protein. J Clin Microbiol 1988;36:1750-1755.

Adresa autora:
MVDr. František Kostka
Oddělení patologie SVÚ Jihlava
Rantířovská 93
586 05 Jihlava

Kompletní text včetně obrazového materiálu naleznete ve Veterinářství 2002;52:401-402.