N. SEBESTIANOVÁ, M. VÁVROVÁ, H. ZLÁMALOVÁ GARGOŠOVÁ
Fakulta veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
SOUHRN
Sebestianová, N., Vávrová, M., Zlámalová Gargošová, H. Posouzení vhodnosti vybraných druhů drobných zemních savců pro potřeby biomonitoringu. Veterinářství 2001;51:524-528.
Při sledování úrovně kontaminace agrárních ekosystémů bývají používány bioindikátory živočišného původu, o nichž je známo, že mohou obsahovat podstatně vyšší koncentrace některých organických polutantů, než jsou koncentrace běžně detekované v ovzduší, vodě a půdě. Pro potřeby monitorizačních studií terestrických ekosystémů bývají využíváni také drobní zemní savci. V práci bylo provedeno ověření vhodnosti drobných zemních savců pro chemický monitoring. Tento monitoring byl ověřován na podkladě zjišťování indikátorových kongenerů PCB. Na základě zhodnocení typu stravy vybraných druhů a obsahu lipidů v kůži a ve tkáních byly vybrány následující druhy drobných zemních savců: hraboš polní (Microtus arvalis), norník rudý (Clethrionomys glareolus), myšice lesní (Apodemus flavicollis) a myšice křovinná (Apodemus sylvaticus). Koncentrace kongenerů PCB byla sledována v kůži, svalovině a játrech drobných zemních savců, případně v jejich celé trávicí soustavě. Bylo zjištěno, že drobní zemní savci mohou být vhodným bioindikátorem používaným pro hodnocení úrovně kontaminace plošně větších i menších ekosystémů.
SUMMARY
Sebestianová A, Vávrová M, Zlámalová Gargošová H. Assessment of suitability of selected species of small terrestrial mammals for the monitoring of environmental xenobiotics. Veterinářství 2001;51:524-528.
An effective tool for the monitoring of environmental contamination of agrarian ecosystems are bioindicators of animal origin which are known to contain considerably higher concentrations of some organic pollutants than other matrices, such as air, water, or soil. Small terrestrial mammals are also used in the monitoring of terrestrial ecosystem in some countries. The major objective of this study was to test the suitability of small terrestrial mammals for chemical monitoring. Considering the nutrition habits and lipid content in the skin and other tissues, the following species were selected: field vole (Microtus arvalis), bank vole (Clethrionomys glareolus), wood mouse (Apodemus flavicollis), and yellow necked mouse (Apodemus sylvaticus). The concentrations of PCB congeners were determined in the skin, muscles and the liver, or, in some cases, in the whole digestive tract. It is concluded that small terrestrial mammals are a suitable bioindicator for the assessment of contamination rate in both smaller and larger areas.
Pro sledování ekotoxikologických zátěží mohou být jako bioindikátory použiti drobní zemní savci. Výhodou je, že poměrně velký soubor jedinců má značnou vypovídací schopnost vůči dané lokalitě. Doporučuje se využívat především ty druhy drobných zemních savců, které se živí převážně rostlinnou potravou. Patří sem zejména hraboši, myšice a norníci.1 V naší studii byli sledováni následující čtyři druhy drobných zemních savců:
Hraboš polní (Microtus arvalis). Je nejznámější a nejběžnější evropský druh hraboše, rozšířený od Atlantiku po horní tok Volhy a podhůří Uralu. Dosahuje velikosti 8- 13 cm (ocas 2,1–5,1 cm) a hmotnosti 15–40 g. Přednostně se živí zelenou potravou bohatou na bílkoviny, denní spotřeba může dosáhnout až 125 % hmotnosti zvířete. Na podzim a v zimě přechází na podzemní části rostlin. Při přemnožení působí hraboš polní značné škody na polích a může být i zdrojem onemocnění přenosných na člověka.
Norník rudý (Clethrionomys glareolus). Je to lesní, relativně dlouhoocasý hraboš. Lze ho naleznout všude v lesích, ale stačí mu i malý remízek, pár stromů na hrázi rybníka nebo křovinatá mez, případně rozsáhlejší rákosiny. Dospělý jedinec obývá území 0,1–0,7 ha. Norníci dobře šplhají, takže nejsou při shánění potravy odkázáni jen na sběr na zemi; okusují pupeny, výhonky, jehličí i kůru. Na jaře se mohou živit i živočišnou potravou, na podzim pak bukvicemi a žaludy. Při přemnožení škodí na lesních porostech tím, že ohryzávají mladé stromky.
Myšice křovinná (Apodemus sylvaticus). Je náš nejběžnější hlodavec, vyskytuje se všude mimo souvislé lesní porosty a může osidlovat i haldy, výsypky a městskou zástavbu. Na podzim se na venkově stahuje do lidských obydlí, do stájí a seníků. Aktivní je zejména v noci a v porovnání s hrabošem je pohyblivější a dovede dobře skákat. Jedinec obývá území o rozloze 1 až 2 hektary. Přestože si nory hrabe blízko pod povrchem, je čilá po celý rok, jen v největších mrazech upadá do strnulosti, která však není ekvivalentní zimnímu spánku. Dosahuje velikosti 7,7–11,1 cm a hmotnosti 13 až 39 g. Jídelníček je tvořen zejména semeny a plody, často si jej zpestřuje mechy, lišejníky, květy, houbami a také drobnými živočichy.
Myšice lesní (Apodemus flavicollis). Chováním, dobou březosti i jídelníčkem je velmi podobná myšici křovinné. Na rozdíl od ní však obývá výhradně souvislé lesy, případně břehy potoků se souvislým stromovým porostem. Rozdíl od předchozího druhu je patrný zejména ve zbarvení, na krku má žlutou skvrnu a ostrou hranici mezi hnědým hřbetem a bílým břichem a proto ji starší názvosloví uvádí jako myšici žlutohrdlou. Je větší než myšice křovinná.
Jak již bylo konstatováno, bioindikátory mají pro hodnocení úrovně znečištění ekosystémů velký význam. Možnost použití drobných zemních savců jako bioindikátorů skýtá výhody v několika směrech. První je ekonomická nenáročnost pro monitoring; drobní zemní savci jsou mnohem lépe dostupní a to ve větším množství, než obvyklé bioindikátory jako jsou lovná zvěř nebo hospodářská zvířata. Další výhodou je jejich úzký vztah k dané lokalitě,2 protože nemají tak velká teritoria jako větší lovná zvěř. V neposlední řadě poskytují možnost sledování vlivu znečištění v kratším časovém úseku na více generacích (možnost studia chromozomálních aberací). Průměrná délka života (tedy i maximální doba expozice) výše uvedených drobných zemních savců se pohybuje kolem 1,5 roku.3
Práce týkající se koncentrace PCB ve tkáních drobných zemních savců nejsou příliš časté a vesměs hodnotí účinek PCB jako sumy; nevztahují se na účinek jednotlivých indikátorových kongenerů PCB. Kontaminací PCB v malé části ekosystému, ve vztahu k bioindikátorům, se zabývali v Kanadě. Sledovali úroveň kontaminace životního prostředí a následně prováděli ekotoxikologické hodnocení, a to na ptácích živících se drobnými zemními savci. Studie neposkytla jednoznačné výsledky použitelné pro naši práci a to zejména proto, že analyzované živočišné druhy nelze srovnávat s druhy žijícími v ČR.4 Komplexní ekotoxikologickou studii týkající se vlivu PCB na myši uvedli další autoři, kteří sledovali druh Peromyscus leucopus. Na podkladě získaných údajů doporučili tento živočišný druh jako vhodný bioindikátor,5 shodně s dalšími autory.6
Materiál a metody
Drobní zemní savci jsou jedinci se značně variabilní hmotností. Vybrané druhy, tj. hraboš polní, norník rudý, myšice lesní a myšice křovinná, se živí převážně rostlinnou potravou a proto je jejich využití jako bioindikátorů pro hodnocení úrovně znečištění ekosystémů opodstatněné. Protože nebylo možné zjistit potřebné údaje o lipidickém podílu, zabývali jsme se v prvé řadě jeho stanovením v jednotlivých matricích. Za tímto účelem byla odlovena větší skupina drobných zemních savců (68 ks), která byla rozdělena podle druhů. Obsah lipidického podílu byl zjišťován u 20 ks hraboše polního (Microtus arvalis), 20 ks norníka rudého (Clethrionomys glareolus), 16 ks myšice lesní (Apodemus flavicollis) a 12 ks myšice křovinné (Apodemus sylvaticus). U každého kusu bylo zjištěno pohlaví a hmotnost v g. Zvlášť byly vypreparovány vnitřnosti s obsahem břišní dutiny, kůže a svalovina a zjištěna jejich hmotnost, obsah tuku v gramech a v %. Odlov drobných zemních savců pro stanovení PCB byl prováděn v letech 1996 až 1998. U každého jedince byly odebrány odděleně ledviny, játra, svalovina, kůže a zbytek trávicí soustavy. Vzhledem k velikosti vzorků a obsahu tuku byly z individuálních vzorků smíchány vzorky kompozitní a indikátorové kongenery PCB byly zjišťovány pouze v kůži, svalovině, trávicí soustavě a nebo v játrech. Vzorky ledvin nemohly být vzhledem ke své velikosti a hmotnosti analyzovány.
Pro analýzu byly použity vzorky, které pro naše účely byly smluvně odloveny a pro analýzu zpracovány odborníky z Ústavu ekologie krajiny ČAV v Brně. Metoda spočívala v odlovu drobných zemních savců do sklapovacích pastí. Úlovek byl vždy po 24 hodinách sbírán a odvážen na pracoviště, kde byl skladován při teplotě –10 °C až do okamžiku pitvy. Při pitvě byla zoologickými metodami určena příslušnost k určitému biologickému druhu; dále bylo určeno pohlaví a pohlavní aktivita.7 Určení příslušnosti k určitému biologickému druhu prováděli pracovníci příslušného ústavu ČAV.
Stanovení lipidického podílu
Postup používaný pro zjištění obsahu tuku v jednotlivých tkáních (gravimetricky): vzorky tkání myší a obsahu břišní dutiny (kůže, svalovina a trávicí soustava) byly důkladně zhomogenizovány. Homogenát vzorku byl za účelem odstranění vlhkosti rozetřen s předem vysušeným bezvodým síranem sodným na sypkou směs, která byla vpravena do extrakčních patron Soxhletova extraktoru. Extrakce byla prováděna diethyletherem a probíhala kontinuálně po dobu 6 hodin. Po odpaření rozpouštědla byl získaný tuk zvážen a proveden výpočet lipidického podílu v g/100g tkáně. Takto byly upravovány pouze vzorky pro stanovení % lipidického podílu.
Postup používaný pro izolaci lipidického podílu pro stanovení PCB: jednotlivé vzorky tkání myší byly důkladně zhomogenizovány. Homogenát byl za účelem odstranění vlhkosti rozetřen s předem vysušeným bezvodým síranem sodným na sypkou směs, která byla vpravena do extrakčních patron Soxhletova extraktoru. Extrakce byla prováděna směsí n-hexan : diethylether (94:6) a probíhala kontinuálně po dobu 8 hodin. Po odpaření rozpouštědla byl získaný tuk zvážen a proveden výpočet lipidického podílu v g/100g tkáně. Z takto získané tuku bylo naváženo potřebné množství na stanovení PCB. U každého vzorku byla provedena dvě paralelní stanovení. PCB již nebyla stanovována ve vzorcích celé trávicí soustavy, nýbrž v kompozitním vzorku jater.
Veškeré koncentrace analytu uvedené v tabulkách I-III jsou vyjádřeny v μg/kg tukové tkáně.
Pracovní postup. Ke stanovení PCB byla použita navážka vyextrahovaného lipidického podílu v rozmezí 0,1–0,2 g. Navážený tuk byl podle velikosti navážky rozpuštěn v 1–2 ml n-hexanu a kvantitativně vpraven na kolonu pro sloupcovou chromatografii, naplněnou aktivovaným florisilem. Jako eluční činidlo byla zvolena směs n-hexan : diethylether (94:6) o objemu 70 ml. Extrakt byl pomocí RVO odpařen a odparek rozpuštěn v 1 ml rozpouštědla. Pokud nebyly pomocí kolonové chromatografie odstraněny veškeré koextrakty, bylo provedeno dočištění kyselou hydrolýzou s využitím kyseliny sírové. Přečištěný extrakt o konečném objemu 1 ml byl převeden do vialky, uzavřen a takto připraven pro vlastní analýzu HRGC/ECD.
Plynová chromatografie
Podmínky analýzy byly modifikovány tak, aby došlo k separaci PCB 28 a PCB 31 a rovněž PCB od dalších interferujících látek (např.o,p´-DDE a PCB 101, nebo p,p´-DDT a PCB 138). Dále byly zvoleny podmínky analýzy tak, aby bylo zabráněno interferenci některých ftalátů při detekci pomocí ECD. Podrobný popis metody je součástí SOP naší laboratoře.8
Pracovní podmínky: kolona: HP 5 (Hewlett-Packard), délka 60 m, vnitřní průměr 0,25 mm, tloušťka filmu 0,2 mikrom.; injektor: split/splitless (150s), teplota, 250 °C, nástřikové množství 1 μl, doporučená technika „hot needle“; nosný plyn: helium-lineární rychlost 16,5 cm.s-1 ; teplotní program: 40 °C po dobu 2,5 min, poté nárůst 30 °C.min-1 do180 °C, nakonec po 2 °C.min-1 do 280 °C; 280 °C po 10 min.; detektor: 63 Ni ECD, teplota 300 °C; programování tlaku: konstantní průtok 1,0 m.min-1 .
K vlastnímu stanovení bylo použito přístroje GC-ECD fy Hewlett Packard, model 5890, série II. K identifikaci jednotlivých indikátorových kongenerů PCB a ke kvantitativnímu stanovení bylo použito metody vnějších standardů. Jako standardy byly využity certifikované materiály dle EPA fy Baker, jako nejvhodnější referenční materiál byl zvolen extrahovaný tuk fy Ehrenstorfer, R 9000012 Butterfat with Organochlor Pesticides and PCBs.
Výsledky a diskuse
V této části jsou pro názornost uvedeny výsledky jednoho pokusu prováděného v uvedeném časovém období. Hodnoty presentované v tabulkách poskytují údaje týkající se obsahu lipidů ve tkáních vybraných druhů drobných zemních savců, tj. hraboše polního (Ma), norníka rudého (Cg), myšice křovinné (As) a myšice lesní (Af). Kromě stanovení lipidického podílu bylo provedeno také zhodnocení kontaminace drobných zemních savců PCB. Odlov drobných zemních savců byl proveden v lokalitách ŠZP VFU Brno, účelové výzkumné zařízení Nové Dvory a Boršice u Buchlovic, katastr Proštípená.
V tabulce I je uveden průměrný lipidický podíl u jednotlivých vyšetřovaných druhů a to s ohledem na pohlaví. Nejvyšší průměrný obsah lipidů byl vypočten v trávicí soustavě u As/F (4,98 g/100 g), v kůži u As/M (12,98 g/100 g) a ve svalovině 3,64 g/100 g u Ma/M. Pro další využitelnost drobných zemních savců je pro potřeby monitoringu nutné brát v úvahu to, že směsný vzorek by měl být složen minimálně z pěti jedinců, pokud nechceme před každým vyšetřením provádět podrobné zjišťování lipidického podílu.
V tabulce II je prezentována průměrná koncentrace indikátorových kongenerů PCB ve vyšetřovaných matricích v ekosystému ŠZP VFU Brno, účelové výzkumné zařízení Nové Dvory. V této tabulce nejsou koncentrace PCB uváděny s ohledem na pohlaví a druh, protože nebyly prokázány signifikantní rozdíly. Z výsledků je zřejmé, že ve vyšetřovaných matricích se, kromě svaloviny, vyskytovaly všechny indikátorové kongenery. Ve svalovině byla koncentrace PCB 52 a PCB 101 pod mezí detekce použité metody. Zjištěné koncentrační hladiny však nelze jednoznačně připsat kontaminaci pocházející ze specifického komerčního přípravku s obsahem PCB. Vzhledem ke krátké době života příslušných živočišných druhů byl zdrojem kontaminace PCB pravděpodobně znečištěný ekosystém. Ve všech vyšetřovaných matricích byla prokázána nejvyšší koncentrace u PCB 28, dále PCB 118, 153 a PCB 180. Nálezy PCB 138 byly, v porovnání s PCB 153 a 180, nižší. Kontaminace PCB 28 a PCB 118 bývá spíše připisována vlivu nížechlorovaných PCB. Obdobně byly také zpracovány výsledky pro lokalitu Boršice u Buchlovic (tabulka III). V tomto případě byly ve všech matricích detekovány všechny sledované indikátorové kongenery PCB. I v této lokalitě byla nejvyšší průměrná koncentrace zjištěna u PCB 28, dále následují u svaloviny a jater PCB 118; hladiny ostatních kongenerů se od sebe mnoho neliší. Porovnáme-li tyto údaje s předchozí lokalitou je zřejmý obdobný trend. Na základě uvedených výsledků nelze rozhodnout, která z lokalit je více znečištěna, přestože ekosystém Nové Dvory se nachází nedaleko Brněnské přehrady, částečně využívané jako zdroj pitné vody pro město Brno. Vyšší kontaminace PCB je v různých vzorcích pocházejících z tohoto ekosystému zjišťována i nadále a proto volba tzv. „čisté“ lokality zřejmě nebyla optimální. Naproti tomu ekosystém Boršice u Buchlovic je situován v oblasti vzdálené vzdušnou čarou 5 km od závodu Colorlak, který do roku 1987 používal při výrobě barev a laků komerční přípravek Delor 106 za účelem zlepšení jejich viskozity. Naše údaje korespondují s údaji s literárními údaji publikovanými ve Slovenské republice, kde na základě hodnocení hladin PCB ve tkáních lovné zvěře byly rovněž prokázány vysoké hodnoty u kongeneru PCB 28 a to téměř u všech sledovaných druhů (zajíc, jelen, bažant); u divokého prasete a srnce se tento trend nepotvrdil. Analyzované vzorky byly odebírány v lokalitě Chemko Strážské, kde byl v letech 1959 až 1984 vyráběn komerční přípravek Delor.9
Závěr
Byl proveden výběr drobných zemních savců, živících se převážně rostlinnou potravou. Při výběru byla hlavním a nejdůležitějším kritériem vhodnost použití drobných zemních savců pro potřeby biomonitoringu a chemického monitoringu. Na podkladě zhodnocení skladby potravy a obsahu lipidů ve zvolených komoditách, t.j. v kůži, svalovině, játrech, případně v celé trávicí soustavě, byly vybrány následující druhy drobných zemních savců: hraboš polní (Microtus arvalis), norník rudý (Clethrionomys glareolus), myšice lesní (Apodemus flavicollis) a myšice křovinná (Apodemus sylvaticus).
Na základě provedených sledování a porovnáním s koncentracemi kongenerů PCB stanovenými u jiných druhů bioindikátorů živočišného původu bylo ověřeno, že drobní zemní savci mohou být použiti jako vhodný bioindikátor pro hodnocení úrovně plošně větších i menších agrárních ekosystémů a lze pomocí nich získat takové údaje o kontaminaci, které plně korespondují s údaji získanými při zjišťování koncentrace PCB v matricích pocházejících z lovné zvěře. Detekovaná zátěž drobných zemních savců xenobiotiky typu PCB poskytuje větší výhodu při interpretaci znečištění v příslušné lokalitě, než to umožňuje obdobně detekovaná zátěž PCB prokázaná v matricích z lovné zvěře.
Bylo zpracováno v rámci řešení výzkumného záměru MŠMT ČR (CEZ: J16/98:162700004).
Literatura:
1. Kratochvíl J a kol. Hraboš polní (Microtus arvalis), Praha;ČSAV, 1959:65.
2. Vaněk J. Die Methode der zoozőnologischen Bioindikation. In: Bioindicators of Landscape Deterioration TERPIAN – VTEI 5, 1990:66.
3. Pelikán J, Gaisler, J, Rödl P. Živou přírodou. Naši savci. Praha;ČSAV, 1979:164.
4. Dianovský J, Siviková K. Environmental genotoxicity of pollutants to animals. In: Sborník Jihočeské Univerzity, zootochnická řada 1992;9:103.
5. Phaneuf D, DesGrandes J L, Plante N, Radrigue J. Contamination of local wildlife following a fire at polychlorinated biphenyls warehouse in St. Basile le Grand, Quebec, Canada. Archiv. Environ. Contamin. Toxicol., 1995;28(2):145.
6. Batty J, Leavitt R A, Biondo N, Polin D. An ecotoxicological study of a population of the white footed mouse (Peromyscus leucopus) inhabiting a polychlorinated biphenyls - contaminated area. Archiv. Environ. Contamin. Toxical., New York 1990;23(2)282.
7. Vávrová M, Zima S, Gargošová H, Sebestianová N. Posouzení vhodnosti bioindikátorů používaných pro zjišťování úrovně znečištění životního prostředí. In: Sborník referátů „Ochrana zvířat a welfare 1998“. Brno;VFU Brno, 1998:149–151.
8. Vávrová M, Gargošová H, Sebestianová N. SOP 3: Stanovení polychlorovaných bifenylů ve tkáních myší. Brno;VFU Brno, 1997:10.
9. Ciberej J, Bilá A, Breyl I. Poznatky z monitoringu PCB u zveri v areáli Chemko Strážské a. s. Zborník prednášok, 1999:26-29.
Adresa autora:
Mgr. Nora Sebestianová
Ústav ekologie a ochrany životního prostředí
FVHE VFU Brno
Palackého 1-3
612 42 Brno
