P. KOHOUT1, J. BENÁK2, Z. KNOTEK1
1Klinika chorob malých zvířat, 2Ústav patologické morfologie, Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
SOUHRN
Kohout P, Benák J, Knotek Z. Cytologická a histologická diagnostika kulatobuněčných nádorů kůže psů a koček. Veterinářství 2001;51:75-79.
Práce přináší základní informace o klasifikaci kulatobuněčných nádorů kůže psů a koček a srovnává možnosti jejich cytologické a histologické diagnostiky. Je především zaměřena na praktické posouzení diagnostického přínosu klinického vyšetření, cytologických a histologických technik. V tabulkách jsou shrnuty nejdůležitější vlastnosti jednotlivých typů kulatobuněčných nádorů a cytologická kritéria malignity mastocytomů převzatá z histologie. Algoritmy znázorňují praktický postup při posuzování cytologických preparátů, nebo při diferenciaci jednotlivých subtypů nádorů.
SUMMARY
Kohout P, Benák J, Knotek Z. Cytological and histological diagnostics of round-cell skin tumoursa in dogs and cats. Veterinářství 2001;51:75-79.
General information on the classification of round-cell skin tumours in dogs and cats is summarised. Attention is paid to the assessment of practical values of clinical examination and cytological and histological techniques. The most significant traits of individual types of round-cell tumours and cytological criteria for the assessment of malignicity of mastocytomas are presented in tabellar form. Algorithms describe practical procedures for the interpretation of cytological findings and differentiation of tumour subtypes.
Kožní a podkožní nádory se rozdělují na epiteliální, mezenchymální, kulatobuněčné a melanocytární.1 Ačkoliv z hlediska vývoje patří kulatobuněčné tumory mezi mezenchymální neoplazie, jsou pro své morfologické vlastnosti uváděny jako samostatná skupina. Kulatobuněčné kožní tumory jsou velmi heterogenní skupinou, která se liší nejen svým biologickým chováním navzájem, ale i v rámci jednoho typu nádoru.
Cytologicky se obvykle kulatobuněčné tumory vyznačují vysokou celularitou (velký počet buněk v cytologickém preparátu). Velikost buněk je malá až střední a v preparátu jsou rozmístěny jednotlivě (nevytvářejí shluky). Hranice buněk jsou obvykle ostře definované. Buňky kulatobuněčných nádorů mají sférický nebo polygonální tvar. Jsou podobné leukocytům. Další vlastnosti odlišující tyto tumory od ostatních kožních neoplazií jsou shrnuty v tabulce I. Mezi kulatobuněčné tumory se řadí: mastocytom, histiocytom, maligní lymfom, plazmocytom a transmisivní venerický tumor. Do diferenciální diagnostiky kulatobuněčných nádoru v některých případech zahrnujeme melanom, nádor bazálních buněk a málo diferencované epiteliální novotvary.2
Zatímco epiteliální novotvary jsou ve většině případů benigní, u kulatobuněčných nádorů je nutná přesná diagnostika vzhledem k rozdílnosti prognózy a terapie i u histologicky podobných nádorů. Kulatobuněčné nádory se histologicky rozdělují i na jednotlivé typy subtypy (např. mastocytom). Cytologie je všeobecně přesnější v diagnostice kulatobuněčných nádorů než histologie. V případech smíšené buněčné populace v nádoru nebo k přesnému určení stupně malignity je však nutné histologické a v některých případech i imunohistochemické vyšetření.
Cytologická diagnostika se soustřeďuje na určení typu kulatobuněčného nádoru a na zjišťování známek malignity. Nevýhoda cytologické diagnostiky spočívá v nemožnosti hodnocení tkáně jako celku (např. epiteliotropní vs. neepiteliotropní lymfom). Naopak výhoda cytologického vyšetření spočívá v rychlosti a snadnosti provedení v klinické praxi. Pro tyto vlastnosti ji lze využít i při chirurgických zákrocích, kdy ještě v době trvání zákroku určujeme hranice exstirpace tumoru (např. mastocytom).
Mastocytom
Klinická diagnostika: Mastocytomy se velmi liší svým biologickým chováním. Na jedné straně existují kongenitální tumory, které samy regredují, na druhé straně jsou vysoce maligní mastocytomy postihující starší zvířata. Za určitých podmínek může být mastocytom in vitro přenosný, ale o přenosu in vivo chybějí důkazy. Mastocytom představuje 15-20 % všech kožních nádorů psů.3 Vyskytuje se především u boxera, zlatého retrívra a bostonského teriéra. Většinou vytváří jednotlivé léze. Mnohočetné léze (kožní mastocytóza) jsou u psů popsané vzácně. Buněčná kritéria malignity a počet mitóz při histologickém vyšetření vysoce korelují s klinickým chováním tumoru.1 Dosud nebylo stanoveno cytologické hodnocení mastocytomu, které by odpovídalo histologickému hodnocení tumoru a jeho biologickému chování. Cytologie využívá ke stanovení prognózy mastocytomu některá histologická kritéria (tab. II)
Mastocytom u koček je výrazně odlišný od mastocytomu u psů. Představuje 1–6 % všech neoplazií a je druhým nejčastějším kožním tumorem (10-20 %).2 Na kůži vytváří buď jednotlivé, nebo mnohočetné léze, zejména v oblasti hlavy a krku. 33–66 % postižených koček má mnohočetné léze, z nichž blíže neurčené procento regreduje během několika měsíců. Pouze 2 % kožních mastocytomů koček jsou maligní.3 Hodnocení malignity mastocytomu u koček má však jen velmi malou prognostickou hodnotu. U koček je většinou buněčná populace tvořena klasickými žírnými buňkami a tento druh tumoru je klasifikován jako mastocytom, typu žírných buněk. Jenom u 10-20 % tumorů je buněčná populace v převážné míře tvořena buňkami histiocytárního typu - tento tumor je klasifikován jako histiocytární typ mastocytomu.3 Cytologické rozlišení těchto dvou variant je obtížné. Histiocytárním typem tumoru jsou převážně postiženy mladší kategorie koček, především siamského plemene.5 Léze jsou většinou mnohočetné a obvykle vymizí i bez terapie. Kožní mastocytom u koček je nutno odlišit od orgánové mastocytózy. Orgánová forma obvykle postihuje játra a slezinu a na rozdíl od kožní formy má horší prognózu. Z tohoto důvodu by mělo být provedeno u každého kožního mastocytomu koček celkové vyšetření (ultrasonografie dutiny břišní, cytologické vyšetření krve atd.).
Cytologická diagnostika: Mastocyty se dobře barví většinou cytologických barviv. Mastocyty velice snadno exfoliují, preparáty jsou proto velmi celulární. Malý počet buněk se získává jen z nádorů, které degranulují a způsobují edém tkáně. Jednotlivé buňky jsou ostře ohraničeny a většinou se v preparátu vyskytují jednotlivě. Dobře diferencované buňky jsou 7 až 20 mm velké, jádro se barví světle a je uloženo mimo střed na periferii buňky. Jadérka nejsou početná. Cytoplazma obsahuje variabilní množství granul, která se nemusí vždy dobře barvit cytologickými barvivy (například hematoxilin-eozin, barvení dle Papanicolaua). V takových případech mohou být mastocyty zaměněny za lymfocyty, plazmocyty, makrofágy nebo za buňky ostatních kulatobuněčných kožních tumorů.5 Málo diferencované tumory vyžadují k zobrazení granul použití speciálních barviv (viz histologické vyšetření). Granula jsou velikosti od 0,2 do 5 mikrometrů. Čím méně obsahuje žírná buňka granul v cytoplazmě, tím je větší pravděpodobnost maligního chování tumoru. Zvolená technika barvení ovlivňuje barvu a intenzitu granul (modrá až růžová). Někdy může být granul tak velký počet, že mohou zcela zakrýt jádro. V takovém případě se těžko stanovuje maligní potenciál buněk. Mastocytom může obsahovat variabilní množství eozinofilů. Ty se mohou celkovým počtem blížit až počtu mastocytů v preparátu. Mastocytom se může vyskytovat v anaplastické formě, která se vyznačuje jen velmi malým nebo žádným počtem granul v cytoplazmě. U této formy se předpokládá velmi agresivní růst do okolí a vysoký metastatický potenciál. Buňky však vykazují výrazné známky malignity v podobě anizocytózy, anizokaryózy, nukleárního pleomorfizmu, různého poměru jader k cytoplazmě a velkých jadérek. Při důkladném hledání však můžeme i u značně anaplastických tumorů nalézt několik granul v cytoplazmě buněk.
Cytologie se dá využít pro stanovení hranic excize tumoru. Z exstirpovaného nádoru uděláme několik otiskových preparátů z různých stran a zjišťujeme, jestli obsahují mastocyty. Jestliže je nález pozitivní, je nutno excizi tumoru rozšířit až za oblast, ve které otiskové preparáty neobsahují mastocyty. V případě, že se nepodaří mastocytom kompletně odstranit, je jeho další růst vysoce pravděpodobný.
Histologická diagnostika: Histologický vzhled mastocytomu je velmi variabilní podle stupně diferenciace nádoru. Obecně tvoří mastocytom neohraničené, vysoce infiltrativní masy. Buňky jsou uspořádány v pruhy, trámce či shluky dobře až špatně diferencovaných mastocytů s menším nebo větším množstvím eosinofilů.3 Většina nádorů je lokalizovaná v hlubokém koriu a v podkoží. Téměř nikdy nedochází k přímému kontaktu s epidermis (mezi nádorem a epidermis zůstává úzký lem stlačené dermis – „Grenz zone“). Mitózy a anizokaryóza nejsou kromě III. histologického stupně časté. Rozdíly jednotlivých histologických stupňů shrnuje tabulka II. V některých nádorech jsou v důsledku degranulace patrné edém, krváceniny, nekrózy stěny cév a kolagenolýza. Méně diferencované nádory vyžadují speciální barvení (toluidinová modř, Giemsa, PAS).
Histiocytom
Klinická diagnostika: Histiocytom je častý tumor mladých psů. Většinou (60-80 %) se objevuje u psů do stáří pěti let.1 Kožní histiocytom má původ v Langerhansových buňkách epidermis. Histiocytom se chová ve většině případů benigně. Většinou jde o solitární léze lokalizované na hlavě a končetinách. Šarpejové jsou predisponováni ke vzniku mnohočetného histiocytomu.5 Obvykle spontánně vymizí během 3 až 6 měsíců.
Cytologická diagnostika: V cytologických preparátech je histiocytom málo až středně celulární. Buňky mají pleomorfní charakter, obsahují jedno jádro a mají v průměru 12-26 mikrometrů.5 Anizocytóza je středního typu. Jádro je kulaté, laločnaté, nebo nepravidelně tvarované. Jaderný chromatin je jemně granulovaný. Jádra mohou obsahovat mnohočetná, malá, nevýrazná jadérka. Mitózy pozorujeme ojediněle (na rozdíl od histologických preparátů, kde jsou mitózy četné). Pokud se cytoplazma buněk barví světleji než pozadí, obsahuje tekutina větší množství bílkovin. Regrese tumoru je spojena s infiltrací malými, vyzrálými lymfocyty. Nepřítomnost lymfoglandulárních tělísek a světle se barvící cytoplazma jsou užitečnými znaky pro odlišení histiocytomu od tumorů lymfatické tkáně.5
Histologická diagnostika: Histologicky je histiocytom ohraničený, neopouzdřený dermální novotvar složený z kulatých a polygonálních buněk. Často vytváří pruhy či trámce. Mladé léze jsou převážně tvořeny monomorfní populací histiocytů. Většina nádorů kompletně obliteruje folikuly i adnex. U nádorů v regresi nacházíme mnohočetné nekrózy s lymfocytární infiltrací na bázi nádoru. U starších lézí dochází k ulceracím epidermis s následnou neutrofilní infiltrací. V této fázi je někdy velmi těžké odlišit histiocytom od zánětlivých procesů. Histiocytom je vždy charakterizován vysokou mitotickou aktivitou.
Kožní lymfom
K odlišní jednotlivých typů lymfomů kůže je nutné použít klinické, histologické a imunohistochemické vyšetření.
Klinická diagnostika: Kožní lymfom je vzácně se vyskytující onemocnění koček a psů. Objevuje se jako primární kožní onemocnění, nebo jako součást multicentrického lymfomu, který metastázuje do kůže.6 Primární kožní lymfom se rozděluje na základě histologického určení postižení epidermis a epitelu folikulů na epiteliotropní a neepiteliotropní lymfom.
Epiteliotropní lymfom: Epiteliotropní forma je nejčastějším typem primárního kožního lymfomu.7 Pro epiteliotropní formu je charakteristické vytváření shluků lymfocytů ve formě tzv. Pautrierových mikroabscesů, které jsou však rozpoznatelné pouze na histologických řezech. Lymfocyty patří vždy k T–řadě. Průběh onemocnění je pozvolný a objevuje se u starších zvířat, většinou nad 10 let. Kožní léze vypadají velmi různorodě: 1) generalizovaný pruritický erytém se šupinatěním, 2) mukokutánní ulcerace nebo depigmentace, 3) solitární nebo mnohočetné plaky nebo noduly, 4) infiltrativní a ulcerativní onemocnění dutiny ústní.8 Tato značná variabilita je příčinou široké diferenciální diagnózy (ostatní tumory, granulomy, autoimunitní onemocnění, léková reakce, pyodermie atd.). Orgánové metastázy jsou vzácné.
V cytologii doposud neexistují studie, které by se zabývaly prognostickým hlediskem. Obecně je prognóza nepříznivá.
Neepiteliotropní lymfom: U psů vychází primární neepiteliotropní lymfom v 80 % případů z T-lymfocytů. Většinou jsou postiženy uzliny a v pozdější fázi i viscerální orgány. Není však jasné, zda primárně vzniká kožní lymfom, který způsobuje metastázy, nebo zda jsou současně postiženy i viscerální orgány. Klinické studie podporují spíše první variantu.
Sekundární metastatický lymfom: Difuzní, solitární nebo mnohočetné nodulární kožní léze se mohou objevit na kůži psů a koček současně s postižením jiných orgánů jako projev generalizovaného maligního lymfomu. Lymfatické buňky infiltrují podkoží i dermis a jejich morfologická stavba odpovídá buňkám primárního tumoru.6 Obecně lze u koček v souvislosti s neoplaziemi předpokládat pozitivní průkaz přítomnosti integrovaného FeLV proviru v DNA polymerázovou řetězovou reakcí.9 U koček s kožní formou lymfomu však většinou nezjišťujeme přítomnost FeLV antigenu v krvi.
Cytologická diagnostika kožního lymfomu je založena na detekci lymfatických buněk. Cytologické preparáty jsou obvykle vysoce celulární. Charakteristickým nálezem kožního lymfomu je přítomnost lymfocytů jednoho typu. Vzhled lymfocytů je však u jednotlivých typů lymfomu variabilní. Lymfocyty mají vzhled od malých, dobře diferencovaných buněk (lymfocytární forma)) až po lymfoblastické formy buněk.
Lymfoblastickou formu lze snadno diagnostikovat. Preparáty jsou vysoce celulární. Buněčná populace je tvořena lymfoblasty. Lymfoblasty jsou větší než neutrofily, mají větší množství světle se barvící cytoplazmy a jádro je odtlačeno k periferii buňky. Lymfoblasty mají vysoký poměr jádra k cytoplazmě (vyšší než u ostatních kulatobuněčných tumorů). Jádro je kulaté, oválné nebo laločnaté a často obsahuje několik výrazných jadérek. Mezi lymfoblasty můžeme pozorovat lymfoglandulární tělíska.
Lymfocytární lymfom se skládá z malých, dobře diferencovaných lymfocytů, které nelze odlišit od normální lymfocytární populace. Tento typ lymfomu pak vyžaduje histopatologické vyšetření. Některé formy lymfomu jsou charakterizovány výraznou jadernou atypií: jádra jsou laločnatá s různě hlubokými zářezy způsobujícími lobulaci jader, mohou se vytvářet i bizarní konvoluty, někdy popisované jako „cerebriformní“.
Epiteliotropní forma kožního lymfomu obsahuje často mimo lymfocytární populaci i buňky s histiocytárními znaky. Tyto buňky jsou stejné jako monocyty, mají kulaté nebo laločnaté jádro a větší množství cytoplazmy, která se barví světle bazofilně.
Buňky histiocytárního typu pozorujeme i u histiocytární formy kožního lymfomu, který se projevuje jako mnohočetné, rychle rostoucí plakovité léze u starších psů. Benigní histiocytom se dá odlišit na základě typické buněčné populace a výskytu onemocnění u mladých zvířat. Kromě psů plemene šarpej, kde se vyskytuje mnohočetný histiocytom, jde o jednu nodulární lézi s nejčastější lokalizací na hlavě nebo na končetinách.7
Histologická diagnostika:
Neepiteliotropní lymfom: Nádor je charakterizován nodulární až difuzní infiltrací koria monomorfní populací nádorově změněných lymfocytů. Vzhledem k tomu, že lymfocyty vycházejí jak z B, tak z T lymfocytů, je morfologie velmi variabilní. Nejčastějšími typy lymfomu jsou: lymfom tvořený velkými lymfocyty, imunoblastický typ a histiocytární typ. Nádory tvořené malými lymfocyty a malými lymfocyty s rozštěpeným jádrem nejsou běžné.8 Lymfoblastický a smíšený typ se jako kožní varianta vyskytují vzácně.
Epiteliotropní lymfom: Nejčastějším typem je mycosis fungoides (MF). Zbylé dva typy, pagetoidní retikulóza a Sézaryho syndrom, se vyskytují vzácně. Mycosis fungoides – histologicky je patrný lichenoidní pás lymfoidních buněk infiltrujících epidermis i epitel folikulů. Pro onemocnění jsou charakteristické Pautrierovy mikroabscesy obsahující atypické lymfocyty (rozštěpené lymfocyty s hojnou světlou cytoplazmou). U ulcerovaných lézí je prokázání těchto mikroabscesů velmi obtížné. Sézaryho syndrom je pouze variantou mycosis fungoides s nálezem typických nádorových lymfocytů v krvi („Sézaryho buňky). U pagetoidní retikulózy je v počáteční fázi patrný epidermotropsimus bez postižení dermis. V pozdějších fázích dochází k postižení koria. Je nutné provést imunohistochemické vyšetření, které prokáže, že jde o gama, delta T lymfocyty na rozdíl alfa, beta T lymfocytů u mycosis fungoides.8,9
Plazmocytom (kožní, extramedulární plazmocytom)
Klinická diagnostika: Tumor plazmatických buněk, který pochází z jiných orgánů, než je kostní dřeň, je nazýván extramedulární plazmocytom.11 Byl popsán v trávicím traktu, na jazyku a na dásních. Plazmocytom se objevuje především u starších zvířat a obvykle vytváří alopetické, malé, hladké nodulární léze. V ušním kanále mají léze exofytický charakter. Zvýšený výskyt je zaznamenán u velkých plemen psů. Kožní plazmocytom tvoří přibližně 2 % ze všech kožních tumorů psů.1 U koček se vyskytuje vzácně. Ačkoliv cytologická a histologická kritéria spíše ukazují na maligní povahu tumoru, má klinicky benigní charakter. Excize tumoru je zcela dostačující v 90 % případů. Maligní tumor je zaznamenán jen vzácně. Na rozdíl od myelomu není plazmocytom doprovázen paraneoplastickým syndromem (lýza kostí, hypergamaglobulinemie).
Cytologická diagnostika: Cytologické preparáty jsou vysoce celulární s rovnoměrným rozvrstvením buněk. Typický plazmocyt má kulaté jádro se středním množstvím bazofilní cytoplazmy. Kolem jádra, které je uloženo excentricky, bývá světlejší zóna, která představuje shluk Golgiho aparátů (obr. 13). Často pozorujeme binukleované a multinukleované buňky.12 Na rozdíl od maligního lymfomu se v plazmocytomu nevyskytují lymfoglandulární tělíska.
Histologická diagnostika: Histologicky jde ve většině případů o dobře ohraničený, neopouzdřený novotvar. Obvykle je patrný pleomorfismus buněk, výskyt obrovských a dvoujaderných buněk a vysoký mitotický index. Kulaté až polygonální buňky tvoří jednotlivé shluky obdané jemným fibrovaskulárním stromatem. Buňky mají větší množství eosinofilní cytoplazmy. Charakteristické je prosvětlení kolem jádra. U plazmocytomu nedochází k invazi do epidermis, nádor je separován tenkou vrstvou stlačené dermis („Grenz zone“). Zhruba 10 % plazmocytomů vytváří amyloid.12
Transmisivní venerický tumor
Klinická diagnostika: Přenosný tumor pohlavních buněk dosud nebyl popsán. K přenosu z jednoho jedince na druhého dochází kontaktem při páření. Typicky se léze vyskytují v oblasti genitálií. Lízáním, škrábáním a kousáním se mohou rozšířit i na ostatní části těla (především oronazální oblast). Tumory samovolně vymizí nebo je nutné jejich chirurgické odstranění. Léčbu doplňujeme chemoterapií.
Cytologická diagnostika: Morfologické znaky buněk jsou velmi charakteristické. Buňky jsou kulaté a vysoce pleomorfní s ostře ohraničenou cytoplazmou. Kulaté jádro má hrubý chromatin a jedno nebo dvě výrazná jadérka.13 Velikost buněk je 16-24 mikrometrů. Charakteristickým rysem buněk je přítomnost ostře ohraničených vakuol v cytoplazmě i mimo ni. Ve větším množství se mohou v preparátu vyskytovat mitózy. V menší míře mohou být přítomny lymfocyty a plazmatické buňky.
Histologická diagnostika: Typicky nádor tvoří exofytické nodulární nebo pedunkulující útvary. Buňky jsou uspořádané v pruzích obdaných jemným kolagenním stromatem. Mají hyperchromatické jádro a na rozdíl od dalších lymfoidních buněk větší množství jemně granulované, světle bazofilní cytoplazmy. Mitotický index je obvykle vysoký. Lymfocytární infiltrace se mohou nacházet u nádorů ve stadiu regrese. Často je rovněž přítomna neutrofilní infiltrace vlivem ulcerací.12
Závěr
Z uvedených skutečností vyplývá, že cytologické a histologické techniky nacházejí u psů a koček praktické uplatnění v určení správné diagnózy i při určení prognózy a terapie kožních změn. Cytologické vyšetření je schopné rozpoznat nejdůležitější kulatobuněčné nádory kůže. Ve sporných případech je však nutné využít histologickou diagnostiku, popř. imunohistochemii. Cytologická a histologická diagnostika kulatobuněčných nádorů kůže jsou přínosem pro klinickou praxi malých zvířat.
Tato práce vznikla jako součást řešení projektu MŠMTV č. 61700002.
Literatura:
1. Yager JA, Wilcock BP. Round cell tumors. In: Color atlas and text of surgical pathology of the dog and cat. St. Louis; Mosby, 1994:273-275
2. Miller MA, Nelson SL, Turk JR. Cutaneous neoplasia in 340 cats. Vet Pathol 1991;29:329-336.
3. Wilcock BP, Yager JA, Zink MC. The morfology and behaviour of feline cutaneous mastocytomas. Vet Pathol 1986;23:320-324.
4. Chastain CB, Turk MAM. Benign cutaneous mastocytomas in two litters of Siamse kittens. J Am Vet Med Assoc 1988;193:959-960.
5. Tyler RD, Cowel RL, Meinkoth JH. Cutaneous and subcutaneous lesions: masses, cysts, ulcers, and fistulous tracts. In: Cowel RL, Tyler RD, Meinkoth JH. Diagnostic cytology and hematology of the dog and cat. Mosby; St. Louis, 1999:20-51.
6. Day MN. Immunophenotypic characterization of cutaneous lymphoid neoplasia in the dog and cat. Can J Comp Pathol 1995;112:79-96.
7. Teske E, Van Heerde P. Diagnostic value and reproducibility of fine-needle aspiration cytology in canine malignant lymphoma. Vet Quarterly 1996;18:112-115.
8. Brown NO, Nesbitt GH, Patnaik AK. Cutaneous lymphosarkoma in the dog: a dissease with variable clinical and histological manifestations. J Am Anim Assoc 1980;16:565-572.
9. Tobey JC, Houston DM, Breur GJ. Cutaneous T-cell lymphoma in a cat. J Am Vet Med Assoc 1994;204:606-609.
10. Clark GN, Berg J, Engler SJ. Extramedullary plasmocytomas in dogs: results of surgical excision in 131 cases. J Am Anim Hosp Assoc 1992;28:105-111.
11. Rakoch PM, Latimer KS, Weis R. Mucocutaneous plasmocytomas in dogs: 75 cases (1980-1987). J Am Vet Med Assoc 1989;194:803-810.
12. Richardson RC. Canine transmissible venereal tumor. Compend Cont Ed Pract 1981;3:951-956.
Adresa autora:
MVDr. Pavel Kohout
Klinika chorob malých zvířat
FVU VFU Brno
Palackého 1-3
612 42 Brno
