D. ŠPERLING
Novartis s. r. o., Animal Health, Praha
Veterinářství 2008;58:506-510.
SOUHRN
Šperling D. Etiologicky významné spirochéty prasat – přehled jednotlivých druhů a některé aktuální poznatky.
Spirochéty patří mezi významné původce závažných střevních onemocnění prasat – dyzenterie prasat a spirochétové kolitidy prasat. Druhy slabě hemolytických spirochét Brachyspira intermedia a Brachyspira murdochii, které byly dříve považovány především za nepatogenní mikroorganismy mohou způsobovat mírnou formu kolitidy u postižených prasat, kdy jednotlivé izoláty těchto spirochét se liší ve své virulenci. Izolován a identifikován byl nový původce patřící mezi spirochéty, který je patogenní pro prasata s prozatímním označením Brachyspira suanatina. Izoláty těchto atypických spirochét byly získány a identifikovány poprvé na třech farmách prasat s příznaky průjmového onemocnění a dále byly také izolovány v populaci divokých kachen – Anas platyrhynchos ve Švédsku a Dánsku.
SUMMARY
Šperling D. Etiologically important spirochetes in pigs – an overview of individual species and some current knowledge.
Spirochetes belong to the important causal agents of serious intestinal diseases in pigs – swine dysentery and colonic spirochetosis in pigs. Species of weakly haemolytic spirochetes Brachyspira intermedia and Brachyspira murdochii, which were previously considered to be mainly non-pathogenic micro-organisms can cause mild form of colitis in the affected pigs, when individual isolates of these spirochetes distinguish in their virulence. A new causal agents pertaining to spirochetes pathogenic for pigs and temporary called Brachyspira suanatina was isolated and identified. Isolates of this atypic spirochetes were gained and identified for the first time on three pig farms with signs of diarrhoea as well as in the population of wild dugs – Anas platyrhynchos in Sweden and Denmark.
Úvod
Spirochéty zahrnují více než 200 druhů bakterií, z nichž některé jsou patogenní pro svůj hostitelský druh, včetně člověka, celá řada z nich však patří mezi nepatogenní – komenzální mikroorganismy. Do čeledi Brachyspiraceae patří pouze jediný rod Brachyspira a tato čeleď patří spolu s čeleděmi Leptospiraceae a Spirochaetaceae do řádu Spirochaetales.
V současné době rod Brachyspira zahrnuje sedm druhů medicínsky významných spirochét, a to: B. hyodaysenteriae, B. intermedia, B. murdochii, B. innocens, B. pilosicoli, B. alvinipulli a B. aalborgi. Významnými původci průjmových infekcí především prasat, ale i dalších savců a také ptáků jsou B. hyodysenteriae a B. pilosicoli. Mezi běžně diagnostikované slabě hemolytické spirochéty prasat, které byly považovány za nepatogenní patří především B. murdochii a B. intermedia, které jsou v současné době považovány za možné původce kolitid prasat s mírným klinickým projevem. Dále byly prozatímně označeny tyto nové potencionální druhy spirochét rodu Brachyspira, které čekají na zařazení: B. pulli, B. canis, B. christiani, B. ibaraki a nedávno popsaný druh B. suanatina. Především B. suanatina je novým střevním patogenem významným pro prasata, který je také izolován z ptáků, kteří mohou sloužit jako zdroj infekce pro prasata.
Přehled jednotlivých druhů rodu Brachyspira
B. hyodysenteriae je nejvýznamnějším a nejznámějším zástupcem rodu Brachyspira a způsobuje jednu z ekonomicky nejzávažnějších enterálních chorob prasat – dyzentérii prasat,1 která je charakteristická svou symptomatologií, především krvavými průjmy a následnou vysokou mortalitou postižených prasat v akutní fázi infekce. Je třeba si uvědomit, že jednotlivé izoláty B. hyodysenteriae se mohou lišit ve své virulenci a popsány byly také atypické izoláty B. hyodysenteriae, které nezpůsobily zjevné klinické příznaky onemocnění ani na farmách prasat s vysokým zdravotním standardem chovu.2,3
B. hyodysenteriae byla dále izolována z některých druhů vodních ptáků, kde může také způsobovat nekrotizující typhlokolitýdu.4 Popsána byla též přirozená infekce B. hyodysenteriae u snáškových hejn drůbeže.5 Epizootologicky je významná možnost infekce hlodavců, kteří hrají významnou roli jako potenciální zdroj infekce v chovech prasat postižených DP, což bylo potvrzeno subtypizací, která potvrdila shodný profil kultur B. hyodysenteriae izolovaných z prasat a hlodavců na téže farmě (obr. 1).6
Obr. 1
B. pilosicoli je známa jako původce spirochetózy kolonu prasat7 dále je také důležitým střevním patogenem drůbeže, kde je spolu s B. intermedia a B. alvinipulli jedním ze tří možných původců ptačí intestinální spirochetozy (AIS).8 Brachyspira pilosicoli se odlišuje od ostatních zástupců rodu, kteří mají omezené hostitelské spektrum, schopností kolonizovat celou řadu druhů savců, ptáků, včetně člověka. Na základě několika srovnávacích studií, které se zabývaly charakterizací izolátů B. pilosicoli pocházejících z různých druhů zvířat a člověka v různých geografických oblastech světa naznačovaly možnost mezidruhového přenosu, zvláště pak mezi psy a lidmi.9 V zemích EU byla B. pilosicoli izolována na vyšetřovaných farmách s různou frekvencí výskytu od 1 do 52 %.10-15 Jednotlivé výsledky, zaznamenávající frekvenci výskytu postižených farem, však nelze porovnávat, protože do jednotlivých studií byly zařazovány farmy s příznaky průjmových onemocnění, ale také chovy bez zaznamenaných průjmových onemocněních. V ČR byla zaznamenána 40,1 % frekvence výskytu B. pilosicoli na produkčních farmách prasat bez zaznamenané deprese růstu.16 Úspěšnost izolace a určení prevalence výskytu B. pilosicoli je ovlivněna především častostí a intenzitou používané antibiotické medikace a samozřejmě zákazem používání antibiotických růstových promotorů v EU a v neposlední řadě volbou vhodné diagnostické laboratoře (obr. 2).
Obr. 2
Brachyspira intermedia patří do skupiny slabě hemolytických spirochét (slabá hemolýza na kultivačních mediích pro spirochéty s přídavkem ovčí krve). Často je považována za nepatogenní komenzální součást intestinální mikroflóry prasat a je běžně izolována z klinicky zdravých prasat. V některých pracích je zmiňován pravděpodobný patogenní potenciál B. intermedia pro prasata a schopnost vyvolávat průjmové onemocnění u postižených jedinců, kde se pravděpodobně některé izoláty B. intermedia, liší svou virulencí, schopností kolonizovat tlusté střevo prasat s následnou mírnou formu kolitidy.6 Spolu s B. pilosicoli jsou běžně izolovaným druhem intestinálních spirochét zhruba na 10 % farem drůbeže a to jak u snáškových tak výkrmových typů drůbeže. Charakteristická je genetická diverzita na základě typizace metodou PFGE a přítomnost více odlišných klonů B. intermedia v rámci jednoho chovu drůbeže.17,18 V budoucnu bude potřebné provést studie izolátů B. intermedia pocházejících z farem prasat s diagnostikovanými průjmovými onemocněními a ověřit korelaci mezi různými genotypy těchto spirochét a klinicky se vyskytujícím průjmem u kolonizovaných zvířat, s následnými studiemi virulence u těchto suspektně patogenních klonů B. intermedia. Zajímavé bude také ověření možnosti přenosu izolátů B. intermedia získaných od drůbeže na prasata.
Brachyspira murdochii je slabě hemolytická, hippurát-negativní spirochéta, která je považována za nepatogenní součást intestinální mikroflóry kolonu prasat. V současnosti je však některými autory dávána do souvislosti jako jeden z možných původců spirochétové kolitidy prasat, se schopností kolonizovat sliznici kolonu a vyvolávat katarální kolitidu s klinickými příznaky mírného průjmového onemocnění.19 Schopnost kolonizace enterocytů kolonu a vyvolání průjmové onemocnění u některých izolátů B. murdochii je pravděpodobně způsobeno rozdílnou virulencí izolátů v rámci druhu. Experimentální studie prokázala schopnost kolonizace tlustého střeva B. murdochii, která byla lokalizována především do spirálního kolonu. Mikroskopický nález metodou in situ hybridizace za pomocí specifických sond odhalil kolonizaci střevních krypt s invazí do povrchových vrstev epitelu a u těchto prasat byla zjevná manifestace mírné kolitidy.20
Brachyspira suanatina
V nedávné době byly izolovány z některých druhů divokých kachen a prasat atypické izoláty β-hemolytických, indol-pozitivních spirochét, které jsou považovány za nový druh rodu Brachyspira s prozatímně uvedeným označením Brachyspira suanatina.21 Izoláty atypických spirochét byly získány a identifikovány poprvé na třech farmách prasat s průjmovým onemocněním a také v populaci divokých kachen (Anas platyrhynchos) ve Švédsku a Dánsku. Žádným systémem specifické PCR reakce se nepodařilo izoláty B. suanatina identifikovat, také typizace pomocí PFGE se u těchto izolátů nezdařila. V experimentálních podmínkách bylo prokázáno, že B. suanatina je schopna kolonizovat slepé střevo vodní drůbeže a je schopna vyvolávat specifické leze sliznice střev u divokých kachen, klinické onemocnění u kachen však nemusí být zaznamenáno. Izoláty B. suanatina byly schopny vyvolat v klinické studii provedené na pět týdnů starých prasatech průjmové onemocnění infikovaných kusů.20,21 Tento nově izolovaný druh spirochét prozatímně označený B. suanatina může být potencionálním rizikem pro farmy prasat, které se vyskytují v blízkosti vodních lokalit s výskytem divokého vodního ptactva, které slouží pravděpodobně jako možný rezervoár tohoto mikroorganizmu.
Frekvence výskytu jednotlivých druhů spirochét na farmách prasat v ČR
Ve studii, která byla publikována na 4. mezinárodní konferenci zabývající se spirochétovými infekcemi lidí a zvířat, konané v Praze minulý rok, byla publikována studie, která mapovala výskyt jednotlivých enterálních patogenů prasat na vybraných středně velkých farmách prasat v ČR (500 a více prasnic základního stáda) bez udávané klinické symptomatologie střevních onemocnění ve fázi předvýkrmu a výkrmu prasat.22 Zahrnuto bylo 22 náhodně vybraných farem lokalizovaných v Čechách a na Moravě, kde bylo vždy odebráno na dané farmě 18 vzorků trusu u prasat ve výkrmu ve váze 60 – 70 kg. Jednotlivé vzorky byly vyšetřeny na přítomnost Lawsonia intracellularis, Salmonella spp. a jednotlivých druhů spirochét prasat specifickými kultivačními a PCR metodami. Diagnostika spirochét byla prováděna na TSA agaru a následně byly získané izoláty identifikovány druhově-specifickou PCR (PCR-RFLP) pro určení druhové příslušnosti spirochét. Takto bylo jednotlivě odebráno 396 vzorků a následně vyšetřeno 132 smíšených vzorků pro stanovení frekvence výskytu jednotlivých střevních patogenů (tab. 1).
Brachyspira hyodysenteriae byla izolována na třech farmách (13,6 %). B. pilosicoli byla izolována na deseti farmách což znamenalo 45,4 % frekvenci výskytu. Na sedmi farmách byla přítomna B. pilosicoli ve formě smíšené infekce (31,8 %) což může způsobovat následné diagnostické obtíže a selhávání zvolené terapie. Současný výskyt B. hyodysenteriae a L. intracellularis byla zjištěna na dvou farmách a shodně na dvou farmách byl zaznamenán výskyt smíšené infekce B. pilosicoli a L. intracellularis. Výskyt slabě hemolytických druhů spirochét, jejichž některé izoláty mohou způsobovat mírná průjmová onemocnění a depresi růstu u postižených prasat, byl zaznamenán v případě B. murdochii na 13,6 % farem a B. intermedia na 63,6 % farem. Vysoký výskyt byl zaznamenán u smíšených infekcí B. pilosicoli a B. murdochii, které se ve výkrmové periodě vyskytovaly na 31,8 % farem (tab. 1).
Tab. 1
Diagnostika spirochét: výběr vhodného pracoviště a interpretace vyšetření
Spirochéty jsou kultivačně náročné mikroorganismy, které jsou charakteristické svými růstovými vlastnostmi, náročností na kultivační podmínky, vhodnou volbu růstového média s vhodnou skladbou selektivního suplementu a prodlouženou dobou kultivace. Brachyspiry rostou za anaerobních podmínek na selektivním agaru s přídavkem nejčastěji 5 až 10% defibrinované ovčí krve. Volba selektivní složky, která se skládá ze směsi několika antibiotik, je velmi důležitá a může ovlivňovat negativně růst některých druhů spirochét, především slabě hemolytických druhů. Při interpretaci výsledků bakteriologického vyšetření na úrovni daného chovu je třeba mít na paměti, že u asymptomatických nosičů spirochét, kteří jsou nejčastějším zdrojem infekce prasat, se spirochéty nacházejí v nízkých koncentracích, které se mohou pohybovat v počtech do 102 CFU/g výkalů a navíc mohou být vylučovány intermitentně.23 V klinické fázi infekce DP se zjevným a charakteristickým průjmem se množství spirochét ve výkalech pohybuje v řádech 107 až 1010 CFU/g výkalů.24 Diagnostika spirochétových infekcí na základě zhotovení barvených fixovaných preparátů je zcela nedostatečná. Pro následné stanovení citlivosti a diferenciaci na druhové úrovni je nutné pracovat pouze s čistou kulturou mikroorganismů, která je identifikována na základě molekulárně-genetického stanovení, příkladem vhodného protokolu pro diferenciaci porcinních spirochét je použití metody PCR-RFLP.25 Bez identifikace a stanovení možnosti výskytu smíšených izolátů spirochét nelze získat správné a přesné výsledky citlivosti daného patogenního izolátu. Možnost výskytu smíšených izolátů, kdy se nachází např. původce dyzentérie prasat B. hyodysenteriea spolu s některým slabě hemolytickým druhem spirochét v jednom vyšetřovaném vzorku, je relativně častá a může zkreslovat hodnotu MIC pro B. hyodysenteriae.
Esenciální význam pro získání skutečných a reprodukovatelných hodnot MIC, které jsou nutné pro volbu optimálního terapeutika, či při volbě a výběru případného eradikačního programu vhodného pro daný chov prasat je použitá metoda stanovení citlivosti k antibakteriálním látkám. Nejčastěji používanou metodou je agar-diluční metoda,26 dále se na některých pracovištích používá metoda zřeďování antibiotika v bujónových medií.27 Mezi oběma metodami byla stanovena velmi dobrá shoda a obě jsou vhodné k testování bakterií rodu Brachyspira spp. a snahou je tyto metody standardizovat. Nedávno proběhly mezilaboratorní srovnávací testy (kruhové testy), jejichž cílem bylo porovnat výsledky identifikačních metod a stanovení citlivosti, získané z několika pracovišť zabývajících se touto diagnostickou činností. Tyto snahy směřují k vyšší standardizaci metod laboratorní diagnostiky infekcí vyvolaných zástupci rodu Brachyspira spp.27 Na této činnosti se podílí i Ústav mikrobiologie a imunologie, FVL-VFU Brno. V této souvislosti je nutné připomenout, že zcela nevhodná metoda testování citlivosti u anaerobních mikroorganismů je disková-difuzní metoda.28
Veterinární lékař by měl pečlivě volit výběr pracoviště pro diagnostiku spirochétových infekcí a stanovení hodnot MIC u daných izolátů pro vybraná terapeutika vhodná k léčbě. Součástí výsledkového protokolu by měl být údaj o druhu použitého kultivačního vyšetření, prováděné identifikaci získaných izolátů (druhové určení spirochét) a provedené metodě stanovení citlivosti. Výsledkem by měl být přesný kvantifikovaný údaj o hodnotě MIC pro zvolená antibiotika, na základě kterého lze stanovit vhodnou léčbu a dostatečné dávkování terapeutika v daném chovu. Bez těchto konkrétních údajů nelze sestavovat vhodné terapeutické postupy a přijímat závažná rozhodnutí jako je například vhodný postup ozdravení chovu (obr. 3).
Obr. 3
Závěr
Byl popsán nový druh silně hemolytické spirochéty s prozatímním označením Brachyspira suanatina, která byla izolována z divokých kachen a prasat s klinicky manifestním průjmovým onemocněním. Izoláty B. suanatina byly schopny při experimentální infekci pět týdnů starých prasat vyvolat průjmové onemocnění.
Slabě hemolytické spirochéty B. intermedia a B. murdochii mohou u prasat způsobovat mírné formy katarální kolitidy. Jejich jednotlivé izoláty se mohou lišit svou virulencí pro prasata. Nutná je kvalitní diferenciální diagnostika a druhové určení spirochét se současným vyloučením jiných možných původců průjmů.
Relativně vysoká frekvence výskytu Brachyspira pilosicoli byla zaznamenána na farmách prasat i bez zjevného průjmového onemocnění (45,4 % postižených farem). Přes mírný průběh spirochétové kolitidy prasat jsou však ztráty v takto postižených chovech ve fázi předvýkrmu a výkrmu prasat významné.
Před volbou vhodné antibiotické terapie, postupu ozdravení či eradikace DP v chovech prasat je vhodné, s ohledem na náročnost laboratorní diagnostiky spirochétových infekcí střeva prasat, uváženě volit vhodnou diagnostickou laboratoř.
Literatura:
1. Harris, D. L., Glock, R. D. Mulinn, M. T. Swine dysentery. In: Inoculation of pigs with Treponema hyodysenteriae (new species) and reproduction of the disease. Vet Med Small Anim Clinician 1972;67:61-64.
2. Hampson, D. J., Cutler, R., Lee, B. J. Virulent Serpulina hyodysenteriae from a pig in a herd free of clinical swine dysentery. Vet Rec 1992;131:318-319.
3. Cizek, A., Sperling, D., Smola, J. Asymptomatic infections caused by Brachyspira hyodysenteriae in a herd with a high health status: case study. Proceedings of the 3rd International Conference on Colonic Spirochaetal Infections in Animals and Humans, Parma, Italy 5-7 June 2005:59.
4. Jansson, D. S., Johansson, K. E., Olofsson, T., Råsbäck, T., Vågsholm, I., Pettersson, B., Gunnarsson, A., Fellström, C. Brachyspira hyodysenteriae and other strongly beta-haemolytic and indole-positive spirochaetes isolatér from mallards (Anas platyrhynchos). J Med Microbiol 2004;53:293-300.
5. Feberwee, A., Hampson, D. J., Philips, N. D., La N., van der Heijden M. J. F., Wellenberg, G. J., Dwars R. M., Landman W. J. M. Identification of Brachyspira hyodysenteriae and other pathogenic Brachyspira species in chickens from laying flocks with diarrhea or reduced production or both. J Clin Microbiol 2007;46:593-600.
6. Fellström, C., Holmgren, N. Mice as reservoirs for swine dysentery in a fattening herd. Svensk Veterinärtidning 2005;13:19-21.
7. Hampson, D. J., Stanton, T. B. Intestinal Spirochaetes in Domestic Animals and Humans. CAB International. Oxon, UK 1997.
8. McLaren, A. J., Trott, D. J., Swayne, D. E., Oxberry, S. L. & Hampson, D. J. Genetic and phenotypic characterization of intestinal spirochetes colonizing chickens and allocation of known pathogenic isolates to three distinct genetic groups. J Clin Microbiol 1997;35:412-417.
9. Trott, D. J., Mikozsa, A. S. J., Combs, B. G., Oxberry, S. L., Hampson D. J. Population structure and molecular epidemiology of Serpulina pilosicoli in villages in the Eastern Highlands of Papua New Guinea. Int J Syst Bact 1998;48:659-668.
10. Moller, K., Jensen, T. K., Jorsal, S. E., Leser, T. D., Carstensen, B. Detection of Lawsonia intracellularis, Serpulina hyodysenteriea, weakly beta-haemolytic intestinal spirochaetes, Salmonalla enterica, and haemolytic Escherichia coli from swine herds with and without diarrhea among growing pigs. Vet Microbiol 1998;62:59-72.
11. Thomson, J. R., Smith, W. J., Murray, B. P. Investigations into field cases of porcine colitis with particular reference to infection with Serpulina pilosicoli. Vet Rec 1998;142:235-239.
12. Barcellos, D. E. S. N., Mathiesen, M. R., de Uzeda, M., Kader, T. A., Duhamel, G. E. Prevalence of Brachyspira species isolated from diarrhoeic pigs in Brazil. Vet Rec 2000;146:398-403.
13. Heinonen, M., Fossi, M., Jalli, J. P., Saloniemi, H., Tuovinen, V. Detectability and prevalence of Brachyspira species in herds rearing health class feeder pigs in Finland. Vet Rec 2000;146:343-347.
14. de Arriba, M. L., Duhamel, G. E., Vidal, A. B., Carvajal, A., Pozo, J., Rubio, P. Porcine colonic spirochetosis in Spanish pig herds. Proceedings of the 17th International Pig Veterinary Society Congress. Ames; Iowa, USA 2-5 June 2002:2.
15. Jacobson, M., Löfstedt, M. G., Holmgren, N., Lundeheim, N., Fellström, C. The prevalences of Brachyspira spp. and Lawsonia intracellularis in Swedish piglet producing herds and wild boar population. J Vet Med B 2005;52:386-391.
16. Čížek, A., Šperling, D., Bednař, V., Pejsak, Z., Biksi, I., Martineau, G. P., Sevin, J. L., Hasman, P., Mirt, D. Lawsonia intracellularis and Brachyspira spp. Prevalence in fatteners in the Czech large-scale farms without diarrhea. Proceedings of the 19th International Pig Veterinary Society Congress. Copenhagen; Denmark, 2006;2.
17. Jensen, T. K. Application of fluorescent in situ hybridization for the diagnosis of Brachyspira spp. Proceedings of the 3rd International Conference on Colonic Spirochaetal Infections in Animals and Humans, Parma, Italy 5-7 June 2005:20-21.
18. Phillips, N. D., La, T., Hampson, D. J. A cross-sectional study to investigate the occurrence and distribution of intestinal spirochaetes (Brachyspira spp.) in three flocks of laying hens. Vet Microbiol 2005;105:189-198.
19. Jensen, T. K., Christensen, A. S., Boye, M. Experimental colonic infection by Brachyspira murdochii in pigs. Proceedings of the 3rd International Conference on Colonic Spirochaetal Infections in Animals and Humans, Parma, Italy 5-7 June 2005:66.
20. Råsbäck, T., Jansson, S. D., Johansson, K. E., Fellström, C. A novel enteropathogenic, strongly haemolytic spirochaete isolated from pig and mallard, provisionally designated Brachyspira suanatina sp. nov. Env Microbiol 2007;9:983-991.
21. Jansson, D. S., Råsbäck, T., Wahlström, H., Fellström, C. Experimental infection of mallards (Anas platyrhynchos) with Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira suanatina. The Fourth International Conference on Colonic Spirochaetal Infections in Animals and Humans, Prague, Czech Republic. 2007:32.
22. Šperling, D., Bednář, V., Čížek, A. Lawsonia intracellularis, Brachyspira spp. and Salmonella spp. Prevalence in fatteners on the Czech large-scale farms without diarrhoea. The Fourth International Conference on Colonic Spirochaetal Infections in Animals and Humans, Prague, Czech Republic. 2007;18.
23. Kinyon, J. M., Songer, J. G., Janc, M., Harris, D. L. Isolation and identification of Treponema hyodysenteriae: aid to the diagnosis and treatment of swine dysentery. Proceedings Am Assoc Vet Lab Diagnostic 1976:65-74.
24. Neef, N. A., Lysons, R. J., Trott, D. J., Hampson, D. J., Jones, P. W., Morgan, J. H. Pathogenicity of porcine intestinal spirochetes in gnotobiotic pigs. Infect Immun 1994;62:2395-2403.
25. Rohde, J., Rothkamp, A., Gerlach, G. F. Differentiation of Porcine Brachyspira Species by a Novel nox PCR-Based Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis. J Clin Microbiol 2002;40:2598-2600.
26. Ronne, H., Szancer, J. In vitro susceptibility of Danish field isolates of Treponema hyodysenteriae to chemoterapeutics in swine dysentery therapy. In Proc IPVS 11th Congr Lausanne 1996;126.
27. Råsbäck, T., Fellström, C., Bergsjø, B., Cizek, A., Collin, K., Gunnarsson, A., Jensen, S. M., Mars, A., Tomson, J., Vyt, P., Pringle, M. Assessment of diagnostics and antimicrobial susceptibility testing of Brachyspira species using a ring test. Vet Microbiol 2005;109 229-243.
28. NCCLS, 2003. Methods of antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria, Approved Standard - Fifth Edition. NCCLS document M11-A4. Edited by NCCLS, Wayne, Pennsylvania.
Adresa autora:
MVDr. Daniel Šperling
Novartis s.r.o.
Animal Health
Nagano III
U Nákladového nádraží 10
130 00 Praha 3
email: daniel.sperling@novartis.com
