K. NEDBALCOVÁ, H. HRADECKÁ, Z. KUČEROVÁ
Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno
Veterinářství 2009;59:230-233.
SOUHRN
Nedbalcová K., H. Hradecká, Z. Kučerová: Genotypizace a stanovení profilů vnějších membránových proteinů izolátů Haemophilus parasuis.
Haemophilus parasuis je součástí běžné mikroflóry dýchacích cest prasat, ale může se etiologicky podílet na respiračním syndromu, vyvolávat Glässerovu chorobu nebo septikémii. Všechny faktory patogenity H. parasuis, které některým izolátům umožní vyvolat klinické onemocnění, ještě nejsou známy. Výsledky předkládané práce přispívají k ověření hypotézy, že určité typy DNA profilů a profilů vnějších membránových proteinů (OMP) mohou úzce souviset s virulencí a s místem izolace jednotlivých izolátů H. parasuis. Metodami ERIC-PCR a SDS-PAGE bylo potvrzeno, že izoláty z prasat s příznaky systémových onemocnění vykazují větší homogenitu DNA a OMP profilů než izoláty z respiračního traktu prasat.
SUMMARY
Nedbalcová K., H. Hradecká, Z. Kučerová: Genotypisation and profile determination of outer membrane proteins of Haemophilus parasuis isolates.
Haemophilus parasuis is a common epiphyte of the upper respiratory tract of pigs, but it can participate in respiratory symdrom, cause Glässer’s disease or septicaemia. The factors of H. parasuis pathogenicity that enable some strains to be virulent and consequently cause a clinical disease have not been established yet. Recent studies have shown that specific DNA and outer membrane proteins (OMP) profiles can closely relate to the virulence and body sites of isolation. Using ERIC PCR and SDS-PAGE was confirmed that isolates from systemic sites have considerable homogeneity of DNA and OMP profiles in comparison with isolates from respiratory tract of pigs.
Úvod
Infekce prasat způsobené Haemophilus parauis představují velké ekonomické zatížení chovatelů z důvodů nákladné antibiotické léčby a úhynů zvířat v akutních formách onemocnění.1 I když je H. parasuis považován za běžného epifyta horních dýchacích cest prasat, mohou některé kmeny vyvolat Glässerovu chorobu, která je charakterizována fibrinózní polyserositidou, polyartritidou a meningitidou2 nebo akutní pneumonie bez polyserositid3 a akutní septikémie.4 Zejména v SPF (specific pathogen free) chovech a v chovech s velmi dobrou zdravotní kondicí je průběh infekcí H. parasuis velmi vážný s vysokou morbiditou a mortalitou.5 V konvenčních chovech se H. parasuis podílí na respiračním syndromu, akutní infekce jsou sporadické a klinické onemocnění postihuje převážně mladá zvířata vystavená stresu.6
Dosud je popsáno 15 sérovarů H. parasuis (1 – 15). Velký počet izolátů H. parasuis však bývá sérologicky netypizovatelný. Jednotlivé sérovary i netypizovatelné izoláty se liší ve virulenci a v rámci sérovarů existují mezi jednotlivými izoláty rovněž výrazné rozdíly ve virulenci. Navíc z jednoho zvířete je možné získat více různých izolátů H. parasuis, z nichž některé mohou být avirulentní a na vzniku onemocnění se nepodílí. Proto se zavádí nové diagnostické metody, které by měly umožnit odlišit virulentní izoláty od avirulentních a umožnily by také diferenciaci sérologicky netypizovatelných izolátů.7,8
Ke studiu výskytu a distribuce izolátů H. parasuis v chovech prasat se používá restriction endonuclease fingerprinting (REF) analýza,9 PCR – restriction fragment length polymorphism (RFLP) test10 a v poslední době repetitive element based-PCR (rep-PCR),11 která pomocí ERIC (enterobacterial repetitive intergenic conscensus) primerů umožňuje amplifikací různě velkých DNA fragmentů a po následné separaci elektroforézou odhalení specifických genomových profilů.7,12
Faktory virulence H. parasuis ještě nejsou jednoznačně definovány. Mezi důležité faktory virulence zástupců čeledi Pasteurellaceae, které kolonizují horní dýchací cesty, jsou považovány vnější membránové proteiny (OMP).13 Vztah mezi expresí těchto faktorů a virulencí u H. parasuis je však zatím diskutabilní. Pomocí sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) byly v minulosti u kmenů H. parasuis identifikovány podle OMP dva biotypy – biotyp I a biotyp II.14,15 Izoláty H. parasuis z nosní sliznice zdravých prasat představují biotyp I a izoláty z chovů postižených Glässerovou chorobou většinou odpovídají biotypu II, který je charakterizován dominantními proteiny o molekulové hmotnosti kolem 37 kDa.
V předkládané práci jsou vyhodnoceny DNA a OMP profily izolátů H. parasuis získaných z klinických vzorků nemocných prasat. Následně byl hodnocen vztah DNA a OMP profilů k místu izolace kmene ve snaze najít vztah určitých profilů s předpokládanou virulencí izolátů H. parasuis.
Materiál a metody
Bakteriální izoláty
Bakteriální izoláty byly získány z patologických lézí uhynulých prasat z chovů v České republice. Část izolátů byla získána z klinických vzorků přímo na našem pracovišti, ostatní izoláty byly poskytnuty z jiných diagnostických pracovišť v ČR.
Primokultivace H. parasuis z klinického materiálu byly prováděny na 5% krevním agaru (HiMedia). Vzhledem k závislosti H. parasuis na růstovém faktoru V byl jako zdroj NAD (nikotinamid-adenindinukleotid) použit proužek kmene Staphylococcus aureus. K dalším kultivacím byl využíván čokoládový krevní agar. Kultivace probíhaly přes noc při 37C.
Druhově specifická PCR
Pro diferenciální diagnostiku H. parasuis byla použita druhově specifická PCR.1 PCR probíhala ve 20 µl reakční směsi, obsahující 10 ng vzorku DNA (získané povařením 100 ml bakteriální suspenze v destilované vodě). K reakci byl použit Taq-polymerase Hot Start Master Mix Kit (Qiagen). Amplifikační proces probíhal ve 30 cyklech, skládajících se z denaturace 30 sekund při 94 °C, chlazení při 59 °C 30 sekund a extense při 72 °C po dobu 2 minut. Amplifikovaný produkt o velikosti 821 bp (obr. 1) byl separován horizontální elektroforézou v 2 % agarózovém gelu (SERVA) při 120 V po dobu 30 minut v Tris-borate-EDTA (TBE) pufru (Sigma Aldrich). Gely byly obarveny roztokem ethidium bromidu (0,5 pg / ml) a vizualizovány UV světlem. Jako marker byl použit 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs).
Použité primery:
HPS-forward (5´GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT 3´)
HPS-reverse (5´GGC TTC GTC ACC CTC TGT 3´)
Genotypizace
Genotypizace izolátů H. parasuis byla prováděna metodou ERIC-PCR12 v 50 μl reakční směsi, která obsahovala: 10 ng vzorku DNA (získané povařením 100 ml bakteriální suspenze v destilované vodě), 100 ng obou primerů, 5 μl 10x PCR pufru II (100 mmol/l Tris-HCl, pH 8,3; 500 mmol/l KCl), 5 μl 25 mM roztoku MgCl2, 2 μl každého deoxynucleotide trifosfátu (10 mM), a 1,25 jednotek Taq DNA polymerázy (Qiagen). Amplifikační proces spočíval v iniciální denaturaci při 95 °C po dobu 2 minut, následovalo 35 cyklů zahrnujících denaturaci při 94 °C po dobu 30 s, zchlazení na 50 °C po dobu 30 s, extenzi při 72 °C po dobu 6 minut s finální extenzí při 72 °C po dobu 6 minut. Amplifikovaný produkt byl separován horizontální elektroforézou v 1 % agarózovém gelu (SERVA) při 80 C 1 hodinu v TBE pufru (Sigma Aldrich). Gely byly obarveny roztokem ethidium bromidu (0,5 pg / ml) a vizualizovány UV světlem. Jako marker byl použit 1 kb DNA Ladder (New England Biolabs).
Použité primery:
ERIC-1R (5‘-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3‘)
ERIC-2F (5‘-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3‘).
Izolace vnějších membránových proteinů
Pro izolace vnějších membránových proteinů (OMP) byla použita modifikovaná tzv. rychlá metoda.17 Kultura H. parasuis narostlá přes noc na čokoládovém agaru byla smyta 10 ml PBS a její hustota byla upravena na hodnotu 0,5 – 0,6 při 600 nm. Pak byla suspenze 2x odstředěna 20 minut při 2500 g. Sediment byl resuspendován v 1,5 ml 10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N‘-2-ethansulfonic acid) pufru (pH 7,4) (Sigma Aldrich), vychlazeného na 4 °C. Nakonec byl sediment resuspendován v 1 ml 10 mM HEPES pufru a sonikován na ledu (6x, 10 s při 40 W). Zbytky buněk po sonikaci byly odstraněny odstřeďováním při 17 000 g po dobu 3 minut. Supernatant byl oddělen a znovu odstřeďován při 17 000 g po dobu 40 minut. Získaný sediment obsahující buněčné membrány byl resuspendován v 0,2 ml 10 mM HEPES pufru a sodium lauryl sarcosinate (2 % roztok v HEPES pufru) (Sigma Aldrich) a inkubován 30 minut v pokojové teplotě za občasného protřepání. Následovalo 2x promytí získané suspenze buněčných membrán 0,5 ml 10 mM HEPES pufru odstřeďováním 40 minut při 17 000 g a konečný sediment byl resuspendován v 50 – 100 µl 10 mM HEPES pufru. Koncentrace proteinů byla upravena ředěním destilovanou vodou na koncentraci 1400 μg proteinu na 1 ml pomocí metody na stanovení proteinů bicinchoninovou kyselinou. Upravené membránové suspenze byly uchovány při – 70 °C.
Elektroforéza SDS-PAGE
Elektroforéza probíhala v zařízení Mini-Protean 3 Electrophoresis Cell (Bio-Rad). Dle návodu výrobce byly připraveny SDS-polyacrylamidové gely: 10 % separační gel a 4 % zaostřovací gel.
Ke 25 μl každé membránové suspenze bylo přidáno do 50 μl pufru, obsahujícího 0,5 M Tris-HCl glycerol, SDS, merkaptoethanol a bromfenolovou modř (Applichem). Konečná směs byla povařena 5 minut. Takto upravené vzorky a proteinové standardy (Bio-Rad) byly naneseny na předem připravené SDS-polyacrylamidové gely. Elektroforéza probíhala nejprve 30 minut při napětí 110 V a potom bylo napětí na 90 – 120 minut zvýšeno na 140 V. Po ukončení elektroforézy byly gely barveny barvícím roztokem pro nespecifické barvení proteinů přes noc v pokojové teplotě, za mírného třepání. Druhý den byl gel přenesen do odbarvovacího roztoku. Odbarvovací roztok byl po 30 minutách měněn, dokud nebylo pozadí gelu bezbarvé.
Výsledky
Genotypizace
DNA profily byly stanoveny u celkem 70 izolátů H. parasuis, které byly izolovány z klinicky nemocných prasat. Do souboru vyšetřovaných izolátů bylo zařazeno 31 izolátů prasat s klinickými příznaky Glässerovy choroby (15 izolátů z mozku, sedm z kloubní tekutiny, šest z jater a tři ze srdce). Zbývajících 39 izolátů pocházelo z respiračního traktu. Mezi 31 izoláty pocházejícími z nemocných prasat, která měla klinické příznaky systémového onemocnění způsobeného H. parasuis bylo metodou ERIC PCR získáno šest skupin základních genetických profilů (A, B, C, D, E, F), v rámci některých skupin však byly nalezeny menší modifikace. Genetické profily měly pět a více bandů s molekulárními hmotnostmi v oblasti od 3,0 kb do 100 bp. U zbývajících 39 izolátů z respiračního traktu vyšetřených metodou ERIC PCR byly DNA profily více heterogenní. Bylo nalezeno 13 různých genetických profilů, označených písmeny G – S. Některé izoláty měly shodný profil s izoláty ze systémových infekcí, avšak pocházely z respiračního traktu zvířat ze stejného chovu, ze kterého byly genotypizovány i izoláty z mozku a kloubů. Vždy se jednalo i o stejný sérovar. Oproti tomu v jiných chovech byly genotypizací zjištěny odlišné DNA profily u různých izolátů, i když příslušely ke stejnému nebo odlišnému sérovaru.
Stanovení profilů vnějších membránových proteinů
Profily vnějších membránových proteinů byly stanoveny pomocí SDS-PAGE u 48 izolátů H. parasuis, které pocházely z mozku, kloubů, peritonea, pleury, perikardu, srdce, plic z nemocných zvířat, vykazujících symptomy onemocnění způsobeného H. parasuis. Proteinové profily izolátů z mozku, kloubů a polyserositid (celkem 14 izolátů) byly ve většině případů velmi podobné, ale ne úplně shodné. Mezi těmito izoláty byly nalezeny tři hlavní proteinové profily (1, 2, a 3). Profil 1 byl nalezen ve čtyřech modifikacích, které se lišily v bandech v oblasti kolem 95 a 105 kDa. Profil 1 a 2 měl charakteristické silné bandy v oblasti kolem 37 a 45 kDa. Profil 3 byl odlišný, s dvěma silnými bandy v oblasti kolem 40 a 95 kDa a jedním slabším bandem okolo 50 kDa. Izoláty H. parasuis pocházející z respiračního traktu prasat měly kromě výše popsaných OMP profilů u izolátů ze systémových onemocnění ještě dalších pět proteinových profilů (4 – 9), které se již více od sebe navzájem lišily, s více nebo méně bandy o různých hmotnostech v rozmezí 20 – 100 kDa. U devíti izolátů H. parasuis z respiračního traktu (26,5 %) byly nalezeny i OMP profily, identifikované u izolátů ze systémových infekcí.
Diskuse
Genotypizace izolátů H. parasuis byla provedena podle metody ERIC-PCR, která byla evaluována pro H. parasuis. Využití této metody ke genotypizaci izolátů je doporučováno zejména pro rychlé vyhodnocení nákazové situace v terénu.12 Je vhodná pro studium šíření onemocnění, protože umožňuje zjistit zdroje infekce a počet izolátů, odpovídajících za vzplanutí onemocnění v konkrétním chovu.7,15 Námi získané výsledky korelovaly s výsledky dříve publikovaných prací,15,18 ve kterých byla také nalezena větší podobnost mezi genetickými profily izolátů, které pocházely z polyserositid než u izolátů z respiračního traktu nemocných zvířat. Navíc genotypizací izolátů H. parasuis z klinicky zdravých prasat byly mezi DNA profily zjištěny největší rozdíly.15
Některé studie zabývající se virulencí H. parasuis spojují možnost závislosti stupně virulence jednotlivých izolátů s expresí vnějších membránových proteinů (OMP) nebo celobuněčných proteinů.14 V předkládané práci byly stanovovány OMP profily izolátů H. parasuis z nemocných prasat metodou SDS-PAGE. Výsledky prokázaly, že proteinové profily izolátů H. parasuis ze systémových infekcí byly velmi podobné. U většiny těchto izolátů byl nalezen silný band v oblasti kolem 37 kDa, jehož přítomnost je spojována se vztahem k virulenci izolátů H. parasuis19. Izoláty z respiračního traktu byly více heterogenní a některé měly stejné proteinové profily jako izoláty ze systémových infekcí. Ve shodě s dříve publikovanými studiemi byla také prokázána větší homogenita proteinových profilů oproti profilům DNA.15
Závěr
Výsledky této práce potvrzují důležitost stanovení OMP a DNA profilů pro izoláty H. parasuis, jejichž izolace je v některých případech klinicky nevýznamná. Stupeň homogenity OMP a DNA profilů mezi izoláty H. parasuis může být jedním z vodítek ke stanovení virulence jednotlivých izolátů a jejich schopnosti vyvolat klinické onemocnění.
Literatura
1. Oliveira, S., Galina, L., Pijoan, C. Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections. J Vet Diagn Invest 2001;13:495-501.
2. Amano, H., Shibata, M., Kajio, N., Morozumi, T. Pathologic observations of pigs intranasally inoculated with serovar 1, 4 and 5 of Haemophilus parasuis using immunoperoxidase method. J Vet Med Sci 1994;56:639-644.
3. Little, T. W. A. Haemophilus parasuis infection in pigs. Vet Rec 1970;87:399-402.
4. Peet, R. L., Fry, J., Lloyd, J., Henderson, J., Curran, J., Moir, D. Haemophilus parasuis septicemia in pigs. Aust Vet J 1983;60:187.
5. Tadjine, M., Mittal, K. R., Bourdon, S., Gottschalk, M. Development of new serological test for serotyping Haemophilus parasuis isolates and determination of their prevalence in North America. J Clin Microbiol 2004;42:839-840.
6. Rapp-Gabrielson, V. J., Gabrielson, D. A. Prevalence of Haemophilus parasuis serovars among isolates from swine. Am J Vet Res 1992;53:951-956.
7. Oliveira, S., Blackall, P. J., Pijoan, C. Characterization of the diversity of Haemophilus parasuis field isolates by serotyping and genotyping. Am J Vet Res 2003;64:435-442.
8. Kielstein, P., Rapp-Gabrielson, V. Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis based immunodifusion using heatstable antigen extracts. J Clin Microbiol 1992;30:862-865.
9. Smart, N. L., Miniats, O. P., McInnes, J. I. Analysis of Haemophilus parasuis isolates from southern Ontario swine by restriction endonuclease fingerprinting. Can J Vet Res 1988;52:319-324.
10. Redondo, V. A. P., Méndez, J. N., Blanco, N. G., Boronat, N. L., Martín, C. B. G., Ferri, E. F. R. Typing of Haemophilus parasuis strains by PCR-RFLP analysis of the tbpA gene. Vet Microbiol 2003;92:253-262.
11. Woods, C. R., Versalovic, J., Koeuth, T., Lupski, J. R. Whole-cell repetitive element sequence-based polymerase chain reaction allows rapid assessment of clonal relationships of bacterial isolates. J Clin Microbiol 1993;31:1927-1931.
12. Rafiee, M., Bara, M., Stephens, C. P., Blackall, P. J.: Application of ERIC-PCR for the comparison of isolates of Haemophilus parasuis. Aust Vet J 2000;78:846-849.
13. Biberstein, E. L. Our understanding of the Pasteurellaceae. Can J Vet Res 1990;54:78-82.
14. Morozumi, T., Nicolet, J. Morphological variations of Haemophilus parasuis. J Clin Microbiol 1986;23:138-142.
15. Ruiz, A., Oliveira, S., Torremorell, M., Pijoan, C. Outher membrane profiles and DNA profiles in strains of Haemophilus parasuis recovered from systemic and respiratory sites. J Clin Microbiol 2001;39:1757-1762.
16. Carlone, M. G., Thomas, M. L., Rumschlag, H. S., Sottnek, F. O. Rapid microprocedure for isolating detergent-insoluble outher membrane proteins from Haemophilus species. J Clil Microbiol 1986;24:330-332.
17. Olvera, A., Segales, J., Aragon, V.: Update on the diagnosis of Haemophilus parasuis infection in pigs and novel genotyping methods. Vet J 2007;174: 522-529.
18. Rapp-Gabrielson, V. J.: Haemophilus parasuis. In: Diseases of swine. 8th Ed. Iowa State University 1999:475-482.
Rukopis byl vypracován v rámci projektů MZE-NAZV QH 71053 a MZE 0002716201
Adresa autora:
MVDr. Kateřina Nedbalcová
Výzkumný ústav veterinárního lékařství
Hudcova 70
621 00 Brno
e-mail: nedbalcova@vri.cz
