H. ŠTEGNEROVÁ,1 E. NÁPRAVNÍKOVÁ,2 I. STEINHAUSEROVÁ,2 P. ŠVEC1
1Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta, Česká sbírka mikroorganismů (CCM) Brno
2 Ústav hygieny a technologie masa Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
Veterinářství 2007;57:39-42.
SOUHRN
Štegnerová H., Nápravníková E., Steinhauserová I., Švec P. Identifikace bakterií mléčného kvašení v mase baleném v podmínkách ochranné atmosféry. Cílem práce byla detekce bakterií mléčného kvašení (BMK) ve vzorcích hovězího a vepřového masa, baleného v ochranné atmosféře, a jejich rodová a druhová identifikace. Jako jedna z příčin kažení baleného masa byly identifikovány mléčné bakterie rodu Leuconostoc a Lactobacillus. Kvantitativní nárůst přítomných BMK dosáhl maxima 106 KTJ/g v rozmezí 21 – 28 dnů skladování v závislosti na druhu masa. Po uplynutí této doby bylo balené maso vzhledem k výrazným senzorickým změnám v důsledku probíhajících fermentačních procesů nepoživatelné.
SUMMARY
Štegnerová H., Nápravníková E., Steinhauserová I., Švec P. Identification of lactic acid bacteria in meat packed under the conditions of protective atmosphere.
The goal of this study was detection of lactic acid bacteria in beef and pork packed under the conditions of protective atmosphere and identification of their genus and species. One of the causes of packed meat spoilage were identified lactic acid bacteria as the genus Leuconostoc and Lactobacillus. Quantitative growth of spoilage bacteria reached 106 KTJ/g during 21 to 28 days of meat storage depending on the kind of meat. After this time, meat was inedible due to the strong sensory changes under ongoing fermentation processes.
ÚVOD
Pojem mléčné bakterie zahrnuje skupinu rodů s podobnými fyziologickými a ekologickými znaky.1 Kandler (1983)2 definuje bakterie mléčného kvašení jako grampozitivní nesporogenní mikroaerofilní bakterie. Morfologicky se BMK řadí jak mezi koky, tak mezi tyčinky a obecně neprodukují katalázu. Název této skupiny bakterií je odvozen od jejich schopnosti fermentovat sacharidy na kyselinu mléčnou (homofermentace) jako hlavní výsledný produkt.3
Při heterofermentaci vznikají kromě kyseliny mléčné rovněž kyseliny jablečná, jantarová, mravenčí, octová, etanol a oxid uhličitý. V přírodě se kyselina mléčná vyskytuje ve dvou antipodech L(+) a D(-)
a jako směs obou optických forem.4 Na rozdíl od vyšších živočichů a rostlin, které produkují výlučně L(+) kyselinu mléčnou, BMK tvoří buď L(+) nebo D(-) izomer, případně jejich směs. Typ izomeru je rodově i druhově specifický a je využíván pro klasifikaci BMK.
Některé rody BMK jsou producenty bakteriocinů. Jedná se o sloučeniny bílkovinné povahy, které vykazují baktericidní aktivitu proti omezenému spektru mikroorganismů, většinou úzce příbuzných s daným producentem.5 Rody Lactobacillus, Enterococcus a Bifidobacterium jsou užívány rovněž jako probiotika s cílem kompenzovat účinky škodlivých faktorů, působících na lidský organismus.6
Taxonomie BMK je provázena velkými změnami. Jedná se o velmi heterogenní skupinu, do které patří rody Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Sporolactobacillus, Streptococcus,, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella.7 Mléčné bakterie jsou v přírodě ubikvitárně rozšířené, zejména v místech s vysokými koncentracemi sacharidů, aminokyselin, vitamínů a vyšší tenzí CO2.3 Tvoří součást bakteriálního osídlení respiračního systému a dominantní část mikroflóry trávícího a urogenitálního traktu člověka i zvířat8 a jsou nalézány v klinickém materiálu humánního a animálního původu. BMK jsou významnou složkou mikroflóry potravin (mléčné výrobky, fermentované maso a zelenina, těsto, nápoje). Výběrem vhodných tzv. startovacích kultur (Pediococcus, Lactobacillus) při výrobě fermentovaných produktů lze zajistit jejich požadované příznivé organoleptické vlastnosti (chuť, vůni apod.). BMK vykazují silný inhibiční efekt proti růstu a produkci toxinů ostatních přítomných bakterií. Těchto vlastností se využívá ke zvýšení trvanlivosti a zdravotní nezávadnosti potravin.9 Při balení některých druhů potravin včetně masa a masných výrobků jsou BMK faktorem, který významně ovlivňuje jejich údržnost a senzorické vlastnosti.
Obecně je balení potravin nezbytným technickým postupem pro ochranu a zabezpečení jejich kvality před vnějšími chemickými a fyzikálními vlivy, minimalizuje mechanické poškození, usnadňuje manipulaci a poskytuje spotřebitelům dostatek informací o vlastnostech baleného produktu. Jednou z inovačních technologií je balení v ochranné resp. modifikované atmosféře, při které je třeba v okolí produktu vytvořit plynné prostředí, které se liší od složení vzduchu, a tím dosáhnout zlepšení jakosti a prodloužení trvanlivosti balené potraviny. Balení masa do ochranné atmosféry vyžaduje použití vhodných obalů s interaktivním charakterem, tj. schopností reakce obalu na změny okolního prostředí.10
Rychlý rozvoj samoobslužného prodeje masa v síti supermarketů a snaha o zvýšení kultury prodeje při zachování nutričních a dietetických hodnot masa bez použití razantních konzervačních metod vyžadují věnovat problematice baleného masa a masných produktů náležitou pozornost.11
Materiál a metodika
Bylo zpracováno 30 vzorků výsekového hovězího masa (nízký roštěnec) a 30 vzorků vepřového masa (kotleta bez kosti). Z každého vzorku bylo zhotoveno pět balení po třech plátcích. Z každého balení byly dva plátky určeny pro chemické vyšetření a jeden plátek pro mikrobiologické vyšetření. Jako obalový materiál byla použita tvarovaná miska v kombinaci polypropylen/polyethylen (PP/PE) se savou podložkou, potažená šestivrstevnou folií COMBITHERM MS 70. Všechny vzorky byly baleny v modifikované atmosféře ve složení 80 % O2 + 20 % CO2 (LINDE TECHNOPLYN a.s.) a skladovány v provozních podmínkách při teplotě 0 C až + 4 C po dobu 28 dnů. Vzorky k laboratornímu vyšetření byly odebrány 14., 21. a 28. den skladování. Odebrané vzorky byly podrobeny senzorickému hodnocení metodou strukturované stupnice. Mikrobiologické vyšetření bylo zaměřeno na kvantitativní a kvalitativní stanovení přítomných BMK. Kvantitativní vyšetření bylo provedeno dle ČSN ISO 13721 (56 0125)12 technikou počítání kolonií na pevném agarovém MRS mediu (agar pro Lactobacillus, Merck s. r. o.).
Senzorické hodnocení: Pro stanovení senzorického profilu byly vybrány dílčí vlastnosti (barva masa, vůně, charakter a množství uvolněné tekutiny), u kterých byly stanoveny tři deskriptory. Senzorické hodnocení pomocí strukturované stupnice provádělo po úvodním zaškolení jednorázově sedm posuzovatelů, vybraných náhodným výběrem v rámci pracoviště; barva 1 – svěží, světle růžová (vepřové maso), višňově červená (hovězí maso), 2 – mírně změněná, 3 – výrazně změněná, našedlá až nazelenalá; vůně 1 – typicky masová, 2 – příjemně mléčná, 3 – odpudivá, počátek kažení; tekutina 1 – bez uvolněné tekutiny, 2 – malé množství mírně zakalené tekutiny, 3 – tekutina výrazně zakalená, hustá až lepivá.
Rodová diferenciace: kultivace izolovaných typických kolonií v tekutém MRS bujónu a následně na pevném agarovém MRS mediu v inkubátoru s řízenou CO2 atmosférou (48hod/30 C) byla doplněna morfologickou charakteristikou na základě makroskopického vzhledu a mikroskopie za pomoci Gramova barvení. V návaznosti byly použity konvenční fyziologické a biochemické testy (katalázová reakce, růst při odlišných teplotách 15 C a 45 C, tvorba CO2 z glukózy, tvorba NH3 z argininu a kontrola růstu na masopeptonovém agaru při 30 C aerobně.
Druhová identifikace: byla provedena komerční soupravou API 50CH (bioMérieux) zejména pro druhy rodů Lactobacillus, Lactococcus a Leuconostoc. Principem testu je fermentace 49 odlišných substrátů, která se projevuje různě intenzivní změnou barvy indikátoru. Výsledky byly odečítány po jednom až čtyřech dnech inkubace při 37 C. Konečné vyhodnocení bylo provedeno pomocí identifikačního programu BACTSELEKT pro numerickou identifikaci bakterií mléčného kvašení s použitím matrice LAB API 50 CHL V8.0. Výsledky biotypizace byly ověřeny molekulární metodou (GTG)5-PCR.13 PCR amplifikace byla prováděna v DNA termocykleru (Perkin Elmer 9600). PCR produkty byly zpracovány elektroforézou v 1,5 % agarózovém gelu, rep-PCR profily byly vizualizovány ethidium bromidem.
Diskuse
Studované izoláty tvořily na MRS agaru hladké, lesklé, okrouhlé, mírně vypouklé bílé kolonie se souvislým okrajem o průměru 0,5 – 1,0 mm. Mikroskopické vyšetření bakterií obarvených dle Grama detekovalo případnou kontaminaci, potvrdilo grampozitivitu všech kultur a bylo přínosné pro odlišení laktobacilů a leukonostoků od laktokoků, buněčná morfologie odpovídala rodovému zařazení. Laktobacily tvořily v mikroskopickém preparátu rovné, příp. mírně zakřivené tyčky uspořádané v krátkých řetízcích nebo palisádách, jejich délka byla ovlivněna stářím kultury. Druhy produkující plyn z glukózy vykazovaly tvar krátkých i delších tyček současně. Leukonostoky byly ve tvaru krátkých tyček až kokotyček. Laktokoky vytvářely ovoidní buňky uspořádané v párech nebo řetízcích. Stanovením počtu BMK byl zjištěn kvantitativní nárůst z původního negativního nálezu do maximální hodnoty 106 KTJ/g mezi 21. – 28. dnem skladování (maso vepřové) a 26. – 28. dnem skladování (maso hovězí). V korelaci s těmito výsledky byly zaznamenány výrazné senzorické změny hodnocených vzorků baleného masa mezi 21. – 28. dnem skladování (tab.1 a 2).
Na počátku sledování byla zjištěna typická višňově červená barva svaloviny, vůně masová a nepatrné množství uvolněné masové šťávy. Od 14. dne skladování se barva měnila ve světle červenou, vůně zůstávala typicky masová, objevilo se malé množství mírně zakalené tekutiny. Od 21. dne skladování byla zjištěna barva našedlá, vůně nezměněná a výrazný zákal většího množství uvolněné tekutiny. 28. den skladování vykazovalo maso barvu našedlou až do zelena s odpudivou vůní a lepivým charakterem výrazně zakalené tekutiny, což signalizovalo počátek kažení.
Barva svaloviny zůstávala během 14 dnů skladování původní světle růžová, s typickou vůní a malým množstvím mírně zakalené tekutiny. Od 21. dne skladování se barva masa měnila v našedlou, s mléčně kyselou vůní a výrazně zakalenou hustou tekutinou. Od 28. dne skladování byly všechny sledované parametry výrazně změněné – barva šedá se zeleným odstínem, vůně odpudivá, tekutina výrazně zakalená, lepivá. Údržnost baleného masa byla v návaznosti na tyto výsledky stanovena na dobu 21 dnů pro balené maso vepřové a 26 dnů pro balené maso hovězí.
Na základě morfologické charakteristiky, konvenčních fyziologických a biochemických testů byly ve studovaném souboru vzorků obou druhů baleného masa jako původce kažení identifikovány mléčné bakterie rodu Leuconostoc a Lactobacillus. Identifikované druhy BMK s vysokým identifikačním skóre jsou uvedeny v tabulce 3.
(Identifikační skóre je mírou výlučnosti; identifikace udává procento pravděpodobnosti, že kmen přísluší právě k tomuto taxonu /druhu/ a žádnému jinému. Výsledek má vysokou vypovídací hodnotu s vysokou pravděpodobností správné identifikace).
Tab. 3
V baleném vepřovém mase byla na počátku skladování (14 – 21 dnů) detekována nižší druhová rozmanitost BMK (Leuconostoc sp.), s prodlužující se dobou skladování (21 – 28 dnů) bylo zjištěno širší druhové spektrum BMK (Leuconostoc sp., Lactobacillus sp.).
Kvalitativní zastoupení identifikovaných druhů BMK izolovaných z baleného hovězího masa neprokázalo závislost na délce skladování, v celém průběhu skladování byly identifikovány druhy Leuconostoc sp. a Lactobacillus sp. Konfirmace biotypizace, provedená metodou (GTG)5-PCR, potvrdila výsledky rodové a druhové identifikace. Odchylky byly zaznamenány pouze v identifikaci jednotlivých subspecies v rámci druhu Leuconostoc mesenteroides (ssp. curvatus) a Lactobacillus paracasei (ssp. tolerans).
Během doby skladování baleného masa dochází ke kvalitativním změnám v důsledku enzymatické činnosti mikroorganismů s následným vznikem metabolitů a změnou hodnot pH. Kažení probíhá nejrychleji v potravinách s vysokým obsahem bílkovin, které pro svoji nutriční hodnotu, optimální pH a vysoký obsah vody představují ideální prostředí pro rozvoj přítomné mikroflóry.14
Balení v ochranné atmosféře (v zahraniční literatuře uváděné jako MAP = Modified Atmosphere Packaging) představuje aktivní systém balení se stále širším uplatněním v potravinářském průmyslu, který přispívá k prodloužení trvanlivosti potravin a zvýšení jejich bezpečnosti. Jedná se o balení, založené na cílené interakci mezi obalem a potravinou. Obal je schopen reagovat na změnu podmínek, ve kterých je produkt balen. Principem je výměna vzduchu směsí plynů s inhibičním účinkem na bakterie (nejvíce využívané plyny jsou O2, CO2 a N2). Kyslík stabilizuje červenou barvu masa (koncentrace nad 60 %), vazbou na hemoglobin vzniká oxyhemoglobin. Oxid uhličitý vykazuje bakteriostatický účinek. Dusík je inertním doplňkovým nosným plynem, omezujícím v kombinovaných ochranných atmosférách parciální tlak kyslíku nebo oxidu uhličitého, na maso působí nejméně aktivně. V kombinaci s CO2 (40 – 45 %) se používá pro balení masných výrobků a mas, u kterých není požadován efekt červeného vybarvení – drůbež, ryby. 11
Ochranná atmosféra může být modifikovaná, tj. složení vzduchu je změněno zvýšeným podílem CO2, příp. O2. Regulovaná, řízená atmosféra (CAP – Controlled Atmosphere Packaging) je rovněž druhem ochranné atmosféry. Tato technika s přesně definovanými koncentracemi atmosférických plynů, které jsou aktivně udržovány a monitorovány během skladovací doby, je primárně užívána pro skladování velkoobjemových produktů.15
Nejčastěji využívanou kombinací plynů v ochranné atmosféře pro balení masa je směs ve složení 70 – 80 % O2 + 20 – 30 % CO2. Inhibiční účinnost CO2 na oxidační procesy v mase se projevuje minimalizací barevných změn na povrchu masa a množství uvolněné masové šťávy. Inhibiční efekt oxidu uhličitého se projevuje od koncentrace 5 % a zvyšuje se lineárně do 25 – 30 %.11 Inhibičně působí na doprovodnou, příp. patogenní mikroflóru masa i další produkty metabolismu BMK např. kyselina octová a peroxid vodíku.16 Citlivé jsou zejména gramnegativní bakterie z čeledi Pseudomonadaceae a Enterobacteriaceae. Oxid uhličitý vytváří s vodou slabě disociovanou kyselinu uhličitou, která snižuje pH prostředí a působí bakteriostaticky především na aerobní mikroflóru.17 Následkem zvýšeného podílu CO2 jsou stimulovány zejména mikroaerofilní G+ mikroorganismy – Brochothrix thermosphacta, Leuconostoc spp. a Lactobacillus spp.; rychlost množení je však omezená, což přispívá k prodloužení údržnosti baleného masa. Nevýhodou dlouhodobého skladování masa v ochranné atmosféře je pokles parciálního tlaku O2 (asi 60 %) a vzestup koncentrace CO2. Důsledkem je negativní vliv na senzorické vlastnosti (změna barvy, zápach).
V podmínkách ochranné (modifikované) atmosféry dochází k rozvoji původní psychrotrofní mikroflóry, zejména laktobacilů a leukonostoků,18 což potvrdily i naše výsledky. Na rozdíl od jiných autorů jsme v námi vybraném souboru neidentifikovali bakteriální druh Brochothrix thermosphacta, který se může podílet na kažení jak vakuově baleného masa, tak masa baleného v ochranné atmosféře.19 Běžnou mikroflóru baleného masa reprezentují taxony Lactobacillus curvatus a Lactobacillus sakei.20
Taxon Lactobacillus curvatus jsme shodně identifikovali v mase hovězím i vepřovém.
Laktobacily štěpí během skladování sacharidy s následnou produkcí typických metabolitů – kyselina mléčná, aktivní aminy, etanol, acetát a laktát. Tyto fermentační procesy mají zpočátku pozvolný charakter bez výrazných senzorických změn. Anaerobní zkáza je pomalá a nastává v okamžiku, kdy je dosaženo maxima populace 108 – 109 KTJ/g. Za tuto formu kažení baleného masa jsou zodpovědné zejména mléčné bakterie heterofermentativního typu. Požadavkem při balení masa do ochranné atmosféry je vytvarování a použití vhodných obalů (vaničky s profilovaným dnem, fólie s dobrými bariérovými vlastnostmi), dále stabilita skladovací teploty, minimalizace kritických míst při manipulaci, prodeji a přepravě. Použití perforované proložky pro uvolněnou masovou šťávu přispívá ke zvýšení údržnosti i estetického vzhledu balíčku. Údržnost takto baleného masa je ovlivněna rovněž složením ochranné atmosféry a stoupá v řadě MAP s vysokým podílem kyslíku, MAP bez kyslíku a MAP se 100 % CO2.
Závěr
Základním předpokladem optimálních podmínek balení masa je vždy jeho maximální jakost, dobré vychlazení, stabilita chladírenského řetězce a minimální kontaminace mikroorganismy.
Při balení masa v podmínkách ochranné atmosféry ovlivňují bakterie mléčného kvašení významným způsobem údržnost baleného masa a podílejí se na jeho znehodnocení v důsledku probíhajících senzorických změn. V naší práci byly detekovány mléčné bakterie rodu Leuconostoc a Lactobacillus jako jedna z příčin kažení baleného masa jak hovězího tak vepřového. Po uplynutí skladovací doby v rozmezí 21 – 26 dnů je maso balené v podmínkách ochranné atmosféry nepoživatelné. Informace získané mikrobiologickým vyšetřením baleného masa a vhodná technologie balení, která je rozhodující pro zachování jeho kvalitativních vlastností, přispívají k optimalizaci stanovení doby údržnosti.
Práce vznikla za podpory výzkumného záměru MŠMT 162700005.
Literatura:
1. Adams M. R. Safety of Industrial Lactic Acid Bacteria. J Biotechnol 1999;68:171-178.
2. Kandler O. Carbohydrate metabolism in lactic acid bacteria. J Microbiol 1983;49:209-224.
3. Aguirre M., Collins M. D. Lactic Acid Bacteria and Human Clinical Infection. J Appl
Bacteriol 1993;75:95-107.
4. Plocková K. Studium vlastností mikroflóry používané při výrobě kysaných mléčných výrobků. Kandidátská disertační práce VŠCHT Praha1983;212.
5. Schillinger U. Bacteriocine of lactic acid bacteria. In: Biotechnology and Food Safety. Weiheim Verlag Chemice 1990:431.
6. Klein G., Pack A., Bonaparte Ch., Reuter G. Taxonomy and Physiology of Probiotic Lactic Acid Bacteria. Int J Food Microbiol 1998;41:103-125.
7. Stiles M., Holzapfel W. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Int J Food Microbiol 1997;36:1-29.
8. Schleifer K., Ludwig W. Phylogenetic relationship of Lactic Acid Bacteria. 1995. In: Wood B. J. B., Holzapfel W. H. (eds.) The Genera of Lactic Acid Bacteria,1st ed.:7-17. Blackie Academic and Proffesional on imprint of Champan and Hall. London, UK.
9. Caplice E., Fitzgerald G. F. Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. Int J Food Microbiol 1999;50:131-149.
10. European Food Information Council Newsletter 2002:33.
11. Steinhauser L., Beneš J., Budig J., Gola J., Hofmann I., Ingr I. Hygiena a technologie masa. LAST Brno, 1995;451-452.
12. ČSN ISO 13721 Maso a masné výrobky – Stanovení počtu bakterií mléčného kvašení – Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 C.
13. Gevers D., Huys G., Swings J. Applicability of rep-PCR fingerprinting for identification of Lactobacillus species. FEMS Microbiology Letters 2001;205:31-36.
14. Huis in´t Veld J. H. J. Microbial and biochemical spoilage of food and overview. Int J Food Microbiol 1996;33:1-18.
15. Rao D. N., Sachindra N. M. Modified atmosphere and vacuum packaging of meat and poultry products. Food Review International 2002;18:263-293.
16. Hugas M. Bacteriocinogenic lactic acid bacteria for biopreservation of meat and meat products. Meat Sci 1998;49:139-150.
17. Kröckel L., Hechelmann H. Mikrobiologie der Kühlung, Kühllagerung und Fleischreifung. Fleischwirtschaft 1999;79:90-93.
18. Pipek P. Bakteriociny v masné výrobě. Maso 1995;6:30-35.
19. Taylor A. A., Down N. F., Shaw B. G. A comparison of modified atmosphere and vacuum skin packing for the storage of red meats. International Journal of Food Science and Technology 1990;25:98-109.
20. Gill C. O. Meat spoilage and evaluation of the potential storage life of fresh meat. J Food Protect 1983;46:444-452.
Adresa autora:
MVDr. Hana Štegnerová
Masarykova Univerzita
Přírodovědecká fakulta Česká sbírka mikroorganismů (CCM)
Tvrdého 12
Brno 602 00
