I. OBROVSKÁ, I. STEINHAUSEROVÁ, M. NEBOLA, L. KRKOŠKA
Fakulta veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
Veterinářství 2002;52:421-423
SOUHRN
Obrovská I., Steinhauserová I., Nebola M., Krkoška L. Identifikace druhů masa v masných výrobcích. Veterinářství 2002;52:421-423.
Mezidruhové falšování masa a záměna surovin pro výrobu masných výrobků jsou společným jevem pro mnoho zemí. Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla využita k druhové identifikaci masa v tepelně neopracovaných, tepelně opracovaných a sterilovaných masných výrobcích. Smícháním pěti primerů v příslušných poměrech mohly být druhově specifické fragmenty DNA identifikovány v jedné reakci. Produkty PCR byly následně hodnoceny pomocí elektroforézy. V masných výrobcích bylo reakcí PCR rozlišeno vepřové, hovězí, kuřecí a koňské maso.
SUMMARY
Obrovská I., Steinhauserová I., Nebola M., Krkoška L. Species-specificity of meat and meat products. Veterinářství 2002;52:421-423.
The adulteration of meat species and replacing the raw materials in meat products are phenomena common to many countries. Polymerase Chain Reaction (PCR) was applied to meat species identification in non-heat-processed, heat processed and sterilised products. By mixing five primers in appropriate ratios, species-specific DNA fragments could be identified by only one multiplex PCR. The PCR products were subsequently evaluated using electrophoresis. PCR also made it possible to identify pork, beef, chicken and horse meat species in meat products.
Falšování masa a dozor nad potravinami mají své kořeny již v dávné minulosti. V různých zemích se přistupovalo k problémům spojeným s falšováním masa a jiných potravin odlišně s ohledem na historickou etapu vývoje a hospodářské postavení dané země. Nejstarší předpisy, nařízení a zákony byly většinou citlivým odrazem určité společensko-ekonomické formace a jedním ze znaků kulturní vyspělosti národa, a proto vždy vycházely a opíraly se o stávající obecnější zákony společnosti. Od pradávna jsou někteří lidé ochotni se neoprávněně obohacovat na úkor finanční ztráty a rizika poškození zdraví jiných. Potraviny byly tedy vystavovány falšování ve větší či menší míře již od těchto dob. Každá společnost bez ohledu na letopočet cítila potřebu nezávislého dozoru nad jakostí a zdravotní nezávadností potravin a na ochranu konzumenta byla zaměřena pozornost civilních, společenských i občanských autorit. Falšování potravin zůstalo vážným problémem i v současnosti. Se zvyšujícími se možnostmi falšování se však zároveň rozšiřují možnosti jeho detekce a četnost případů redukuje řada nových opatření a rozvoj moderních efektivních metod.
Metody pro detekci falšování potravin jsou založeny na fyzikálních, chemických, biochemických a mikroskopických technikách. Nĕkteré způsoby falšování potravin se prokazují poměrně snadno. Určitý problém však neustále představuje identifikace jednotlivých druhů masa. Určování druhového původu masa a masných výrobků se dostává v současné době do popředí zájmu odborné i laické veřejnosti. Metody zaměřené na identifikaci druhově specifických proteinových komponent zahrnují metody fyzikálně-chemické, imunologické, metody založené na analýze tuků, histologické a metody molekulární genetiky. Tyto metody jsou schopny potvrdit konkrétní druh masa nebo rozlišit několik druhů masa v masných výrobcích, a tím ověřovat dodržování jejich receptur a deklarací. Stejně tak je možno je využít k identifikaci druhů masa u výrobků neznámého nebo pouze předpokládaného složení. Vývoj v této oblasti směřuje k zavedení takových metod, které by byly schopny identifikovat maso z jakéhokoliv zvířete, včetně masa rybích druhů.
V současné době byla s rozvojem molekulárně genetických metod vypracována řada postupů pro rychlou identifikaci jednotlivých druhů masa, jedná se zejména o metody PCR a PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism). Metody molekulární genetiky jsou založeny na analýze relativně stabilních a vlivům tepelného opracování odolných nukleových kyselin. Pro identifikaci masa jatečných zvířat a zvěřiny se využívá definovaného úseku mitochondriálního genu pro cytochrom b eukaryotických buněk obratlovců. Pro průkaz falšování potravin a tím i pro druhovou identifikaci masa je metoda enzymatického zmnožení nukleových kyselin1 jednou z nejvíce specifických metod a nachází zde své uplatnění. Tato metoda je schopna rozlišit různé druhy masa a je schopna detekovat i nízké procento přídavku masa. Nejedná se pouze o identifikaci tepelně neošetřeného masa, ale i svaloviny pocházející z tepelně ošetřených nebo fermentovaných masných výrobků.
Materiál a metodika
V práci byly vyšetřovány různé druhy průmyslově vyráběných masných výrobků tří odlišných skupin - výrobky tepelně neopracované, tepelně opracované a sterilované. Všechny vzorky masných výrobků byly získány z tržní sítě. V transportním chladícím boxu byly převezeny do laboratoře, kde byly zpracovávány v čerstvém stavu nebo byly uchovávány až do vyšetření ve stavu zmrazeném. Vzorky byly podrobeny molekulární analýze zahrnující extrakci DNA, testování metodou multiplex PCR a hodnocení pomocí elektroforézy na agarozovém gelu. Účelem bylo u vybraných masných výrobků identifikovat obsažené druhy masa a detekované druhy masa porovnat s deklarovanými surovinami uvedenými výrobcem ve složení na jeho obalu.
Extrakce DNA: DNA byla z masných výrobků extrahována modifikovanou metodikou podle Sambrooka.2 Vzorek rozmělněného masa byl suspendován v pufru pro extrakci. Suspenze buněk byla následně lyzována proteinázou K za přidání Tweenu 20 a inkubována ve vodní lázni při 50 °C 1 h. Dále bylo provedeno pročištění fenolem : chloroformem : isoamylalkoholem a dočištění chloroformem. K vysrážení DNA bylo použito acetátu sodného a absolutního etanolu za následného podchlazení při –20 °C po dobu 2 h. Vysrážená DNA byla odstředěna a rozředěna v pufru pro skladování. Rozvolnění DNA probíhalo ve vodní lázni při 60 °C 1 - 2 h. Extrahovaná DNA byla uchovávána krátkodobě v chladničce nebo dlouhodobě v mrazničce.
Polymerázová řetězová reakce – multiplex PCR: Vzorky masa byly testovány metodou multiplex PCR. Pro amplifikaci byly zvoleny oligonukleotidy - primery určující poměrně stabilní úsek na mitochondriální DNA v oblasti genu pro cytochrom b. Primery byly navrženy na základě známých sekvencí tohoto genu u skotu, prasat, drůbeže a koní.3-5 V práci byly využity společný forward primer SIM a reverzní primery C (kuřecí), B (hovězí), P (vepřový) a H (koňský). Pro směs SIM : C : B : P : H byly primery smíchány v poměrech 0,5 : 1,5 : 0,3 : 0,3 : 1,0. Poměr 1 byl představován 20 pmol primeru/25 µl PCR roztoku.6 Společně byly primery použity pro simultánní identifikaci masové směsi.
Reakční mix o objemu 25 µl obsahoval 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 obsahující 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTP mix, primer mix (4 - 60 pmol každý), 2 µl purifikované DNA a 1,25 jednotky Taq DNA polymerázy.7
PCR amplifikace sestávala ze 35 cyklů a byl pro ni použit MiniCycler PTC - 150 (MJ Research) o protokolu: denaturace 94 °C/0,5 min., annealing 60 °C/0,5 min. a extenze 72 °C/0,5 min. Připravena byla také negativní kontrola bez templátu a negativní kontrola. GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas, Lithuania) byl v PCR použit jako molekulární marker.
Elektroforéza: Analyzováno bylo 5 µl produktu PCR pomocí elektroforézy na 3% (w/v) agarózovém gelu (Serva) při 130 V/40 min. v TBE pufru (pH 8,3). K vizualizaci byl použit ethidium bromid (1 µg.l–1) a hodnocení PCR produktů bylo možné pomocí UV transluminátoru.
Výsledky a diskuse
Identifikace druhů masa v masných výrobcích zahrnovala testování masných výrobků tří skupin, výrobky tepelně neopracované, tepelně opracované a sterilované. Pomocí metody multiplex PCR byly u všech testovaných výrobků identifikovány jednotlivé druhy masa ve svých charakteristických velikostech produktů PCR - pro maso kuřecí 227, hovězí 274, vepřové 398 a koňské 439 bp (počet párů bazí). Díky rozdílným velikostem produktů PCR lze jednotlivé druhy masa snadno detekovat. V některých případech je obtížnější rozlišení vepřového a koňského masa, neboť mají podobně velké produkty PCR. U masných výrobků bylo identifikováno jejich druhové zastoupení masa a bylo porovnáno s deklarovaným složením. Určité masné výrobky odpovídaly svým složením deklaraci uvedené výrobcem na obalu, některé výrobky však tomuto deklarovanému složení neodpovídaly, lze tedy předpokládat, že zde došlo k druhové záměně masa a následnému porušení deklarované receptury. Na základě výsledků bylo možno u tepelně neopracovaných masných výrobků konstatovat neporušení deklarované receptury, u výrobků tepelně opracovaných a sterilovaných bylo zaznamenáno porušení deklarace v několika případech. Jednalo se o náhradu jakostního druhu masa druhem masa méně hodnotným. Ve studii zabývající se detekcí druhů masa v masných výrobcích, využili autoři8 k extrakci DNA komerčních kitů, metodou PCR rozlišili směs různých druhů masa v tepelně opracovaných masných výrobcích a detekované druhy masa porovnávali s deklarací výrobku. Zajímavé bylo též hodnocení práce zaměřené na identifikaci vepřového masa ve výrobcích označovaných jako „pork free”, kdy velká část těchto výrobků deklaraci neodpovídala a byl v nich detekován přídavek vepřového masa v úrovni 5 %.9
Dozor nad potravinami nelze provádět bez platných legislativních podkladů. Náplní dozoru je sladění situace ve výrobě potravin s požadavky předpisů, zjišťování nedostatků, sledování příčin, objasňování jejich vzniku a nalézání způsobu odstranění. Cílem jsou zdravotně a hygienicky nezávadné potraviny s potřebnou jakostí, kvalitou a biologickou hodnotou. Kontrolu potravin je možné uskutečňovat pouze pomocí a v rozsahu metod k tomu určených a legislativně podložených. Dozorová činnost spadá do kompetence příslušných kontrolních orgánů. Součástí činnosti kontrolních orgánů je i ochrana spotřebitele před neseriózností výrobců, kteří mají tendenci potraviny falšovat a včasné odhalení jejich nepoctivého jednání. Význam dozoru spočívá v zaměření se na prevenci zdravotních, hygienických, nutričních a ekonomických škod.
S vydáním a nástupem platnosti zákona č. 110/1997 Sb., zákona o potravinách a tabákových výrobcích, ve znění pozdějších předpisů, byla v oblasti potravinářské legislativy v České republice vyřešena řada otázek. Zákon upravuje podmínky pro splnění požadavků na jakost a zdravotní nezávadnost, na označování potravin a doložení země původu, na výrobu, skladování, uvádění do oběhu, ukládání pokut a další manipulace s potravinami a tabákovými výrobky za účelem ochrany zdraví a ekonomických zájmů spotřebitele. Zákon také mimo jiné ukládá výrobcům povinnost uvádět celé složení výrobku na obalu a u nebalených potravin je nutno mít tyto informace k dispozici na prodejně. Použití všech surovin, pomocných a přídatných látek včetně jejich označení musí být v souladu s tímto zákonem. Samotná definice falšování potravin však zákonem stanovená není.
V určitých případech dochází k úmyslné nebo náhodné záměně suroviny. Výsledkem záměny druhu masa je odlišné složení výrobku od deklarovaného složení. Snahy kdy se uvádí nesprávné složení výrobku ve svém důsledku vedou ke klamání spotřebitele. Klamavé označování masných výrobků má negativní dopad na spotřebitele, konzumenta, pro něhož může nesprávné označení výrobku přinést kromě ztráty důvěry i četná zdravotní rizika. K ochraně spotřebitele před falšováním se vztahují ustanovení z výše zmíněného zákona, ale také ustanovení ze zákona č. 634/1992 Sb., o ochraně spotřebitele, ve znění pozdějších předpisů.
Systém kontrolních orgánů v rámci státního dozoru nad potravinami je členěn tak, aby byly jejich kompetence jasně vymezeny a aby se nepřekrývaly. Cílem je skloubit pracovně i legislativně činnost všech kompetentních orgánů. V současné době kdy převládají ve výrobě potravin především zájmy obchodní, poskytne skutečnou ochranu spotřebiteli před jejich falšováním jen důrazné a fungující zákonodárství a činnost kontrolních orgánů v této sféře.
Závěr
Možnosti využití druhové identifikace masa molekulárními metodami:
- Kontrolní orgány, provádějící dozor nad potravinami, mohou u odebíraných vzorků masa a masných výrobků požadovat vyšetření na druhový původ masa a řešit tak problémy mezidruhové záměny masa.
- Spotřebitel má možnost ve spolupráci s kontrolními orgány žádat o vyšetření potvrzující druhový původ masa, v případě podezřelých nálezů a při pochybnostech o složení zakoupeného masa a masných výrobků.
- Při vývozu potravin si mohou vývozci u exportovaného zboží ověřit na základě kontrolních vyšetření druhový původ masa, složení masného výrobku nebo dodržení receptury.
- Při dovozu potravin si mohou dovozci rovněž ověřit, zda importované zboží obsahuje požadované druhy masa a odpovídající složení masných výrobků.
- Celní orgány si mohou ověřit druhový původ masa v rámci mezistátního obchodu u importovaných a exportovaných potravin v případě pochybnosti o pravdivosti deklarovaných údajů.
Metoda multiplex PCR byla využita ke kvalitativní druhové identifikaci masa a její uplatnění v oboru hygiena potravin přispívá především k vyšší bezpečnosti potravin na základě využití genetických faktorů. Podstatou metody je schopnost detekovat druhově specifické proteinové komponenty masa a masných výrobků. Realizace a využití metody v praxi, z jejichž požadavků vyšla i nutnost samotné druhové identifikace masa, závisí na potřebách, podmínkách a finančních možnostech daného pracoviště.
Literatura:
1. Saiki R. K., Schart S., Faloona F., Mullis K. B., Horn G. T., Erlich H. A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985;230:1350-1354.
2. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Could Spring Harbor. New York; Could Spring Harbor Laboratory Press, 1989:580.
3. Anderson S., De Bruijin M. H. L., Coulson A. R., Eperon I. C., Sanger F., Young I. G. Complete sequence of cattle mitochondrial DNA. Conserved features of the mammalian mitochondrial genome. Journal of Molecular Biology 1982;56:683-717.
4. Desjardins P., Morais R. Sequence and gene organization of the chicken mitochondrial genome: A novel gene order in higher vertebrates. Journal of Molecular Biology 1990;12:599-634.
5. Irwin D. M., Kocher T. D., Wilson A. C. Evolution of the cytochrome b gene of mammals. Journal of Molecular Evolution 1991;2:128-144.
6. Chikuni K., Tabata T., Saito M., Monma M. Sequencing of mitochondrial cytochrome b genes for the identification of meat species. Animal Science and Technology (Jpn) 1994;5:571-579.
7. Matsunaga T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Shibata K., Yamada J., Shinmura Y. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Science 1999;1:143-148.
8. Behrens M., Unthan M., Brinkmann Y., Buchholz R., Latus N. Nachweis von Tierarten in erhitzten und komplexen Fleischerzeugnissen durch tierart-spezifische PCR-Reaktionen. Fleischwirtschaft 1999;79:97-100.
9. Meyer R & Candrian U. PCR-based DNA Analysis for the Identification and Characterization of Food Components. Lebensm Wiss u Technol 1996;9:1-9.
Adresa autora:
MVDr. Iveta Obrovská
Ústav hygieny a technologie masa FVHE VFU Brno
Palackého 1 - 3
612 42 Brno
E-mail: obrovskai@vfu.cz
Kompletní text včetně obrazového materiálu naleznete ve Veterinářství 2002;52:421-423.
