P.A. Barrow
Úvod
Během posledních několika let narostly zdravotní problémy veřejnosti spojené se salmonelou do takových rozměrů, že se staly hlavním politickým problémem, který si začala uvědomovat široká veřejnost. Především S. enteritidis se stala celosvětovým problémem, který vyvstal především u drůbeže. V mnoha zemích určité fagotypy tohoto sérovaru nahradily S. typhimurium jako nejvíce dominantní typ u drůbeže a lidí. Kontrola Salmonel u drůbeže se stala přední záležitostí a zdá se, že imunita ať už získaná nebo vrozená, je jedním z prostředků jak zvládnout tento problém. Široké používání antibiotik vedlo k výskytu multi-rezistentních bakterií včetně S. typhimurium. Tento problém ukázal průmyslu a vládním organizacím zvýšený požadavek na účinné vakcíny na zvládnutí této závažné zoonózy.
Tento přehled je pokusem vysvětlit relativně malý úspěch při imunizaci potravních zvířat vůči těmto nespecifickým sérovarům salmonel, které obvykle způsobují otravu potravin, ve srovnání s úspěchem získaným s malým počtem sérovarů, pro které je typické vyvolání systémových tyfu podobných onemocnění u omezeného okruhu hostitelských druhů. Většina našich poznatků o imunitě k salmonelóze pochází z experimentální práce s tyfu podobných onemocněním, obvykle infekce S. typhimurium u myší. Taková práce nemusí být úplně relevantní s kolonizací většiny sérotypů salmonel nezpůsobujících onemocnění. Zatímco živé, atenuované vakcíny proti hostitelsky specifickým sérovarům jsou vysoce protektivní, podobně vyvinuté vakcinační kmeny jsou tradičně méně účinné při ochraně kuřat, telat a prasat vůči kolonizaci střev. Vyvíjejí se nové metody atenuace, které se již začínají používat. Jejich úspěch bude záviset na vhodnosti atenuace a způsobu dodání a na jejich použití pro infekční typy, které se ukázaly být přístupné imunitní regulaci. Avšak z hlediska bezpečnosti spotřebitelů existuje názor, že inaktivované nebo subjednotkové vakcíny jsou nejbezpečnější. Přínos vývoje účinných neživých nebo subjednotkových vakcín ve srovnání s živými vakcínami je enormní. Nedávno bylo dosaženo významného pokroku při vývoji adjuvans, např. mikrosfér, které mají schopnost silné imunostimulace cílením na různé větve imunitního systému. Využití takovéto technologie ve spojení s pokračujícím vývojem zaměřeným na identifikování klíčových determinant salmonelové virulence by mělo formovat novou generaci subjednotkových vakcín proti salmonele na kontrolu této významné skupiny patogenů.
Patogeneze salmonelózy
Vývoj účinné vakcíny závisí na pochopení toho jak salmonelové organizmy infikují své hostitele a jak hostitelé reagují na infekci. Hlavním problémem tohoto úkolu je, že patogenita salmonely je jak sérotypová tak závislá na hostiteli a to, že faktory ovlivňující specifičnost sérotyp-hostitel nejsou známy (viz kapitoly o virulenci).
Z hlediska patogeneze můžeme rod Salmonella rozdělit do dvou hlavních skupin. Pro jednu skupinu je typické vytváření systémových onemocnění a jen zřídka se podílejí na otravě potravin, zatímco druhá skupina způsobuje otravu potravin a jen za zvláštních okolností se podílí na systémových onemocněních jako např. během porodu, při snášce, u velmi mladých nebo velmi starých zvířat nebo po některých virových infekcích. Srovnání biologických aspektů těchto dvou skupin by mohlo vysvětlit náš úspěch při imunologické kontrole první skupiny Salmonel a omezený úspěch u druhé skupiny. Mohlo by to také přispět k pochopení imunitní odpovědi na infekci. Při hodnocení experimentální práce týkající se patogeneze a imunity je zřejmě nejdůležitější porovnávat podobné věci.
Naše současné chápání patogeneze salmonely a imunity je z velké části odvozeno ze studování experimentálních infekcí především S. typhimurium u inbredních plemen laboratorních myší. Pro tento typ infekce je charakteristický malý počet sérovarů, které produkují toto těžké systémové onemocnění, které u omezeného počtu hostitelských druhů zpočátku zahrnuje retikuloendoteliální systém. Po inokulaci myší infekční dávkou se objeví systémové onemocnění bez enteritidy. Tím se myši stávají pouze užitečným modelem pro studování systémové formy onemocnění. Vážnost infekce závisí na virulenci salmonelového kmene, na cestě infekce, vrozené rezistenci použitého plemene myší a jeho imunitním stavu. Podobné informace o S. dublin u skotu nebo S. gallinarum u drůbeže jsou mnohem méně kompletní.
Výše zmíněná druhá skupina zahrnuje zbývajících asi 2000 sérovarů. Nejsou omezeny na určité hostitelské druhy a proto jejich epidemiologie může být složitá. Většina z nich může kolonizovat zažívací trakt zvířat bez toho, že by vyvolávali onemocnění. Rozsáhlá kontaminace jatečných těl na jatkách může být způsobena vstupem salmonel do potravního řetězce člověka.
Některé kmeny určitých sérovarů, zejména S. typhimurium a S. enteritidis jsou schopné za určitých podmínek způsobit klinické onemocnění. Je to zvláště případ mladých kuřat, telat nebo selat, nebo během a po období fyziologického stresu jako je otelení, během snášky, po infekci způsobené motolicemi nebo při chladném, vlhkém počasí. V těchto případech se objevuje systémové onemocnění, které opět zpočátku zahrnuje retikuloendoteliální systém, ještě navíc k vylučování výkaly. Rozsah onemocnění a mortalita kolísá podle toho o který kmen se jedná ale u takovýchto sérovarů vždy dochází k určitému napadení střevní sliznice a retikuloendoteliálního systému.
Imunita k salmonele
Imunitní odpověď na salmonelu závisí na hostitelském druhu a sérotypu salmonel, které infikují hostitele. Sérovary, které obvykle způsobují v omezeném rozsahu gastroenteritidu u velkého počtu nepříbuzných hostitelských druhů a jsou schopné vyvolat systémové onemocnění u velké řady hostitelských zvířat se nazývají neomezené sérotypy nebo sérotypy s širokou škálou hostitelů. Sérotypy s omezeným počtem hostitelů, jako je S. gallinarum u drůbeže, mají zcela odlišnou patogenezi. Tyto bakterie způsobují těžké systémové infekce, které mohou skončit smrtí zvířete. Patogeneze S. gallinarum se vyznačuje šířením po celém těle a těžkým klinickým onemocněním s malým zasažením střeva. Většina údajů týkajících se imunity k salmonele je odvozená od infekce S. typhimurium u myší, což je ve skutečnosti model infekcí podobných tyfu. Proto není vždy relevantní generalizovat tyto informace na hostitelsky nespecifické salmonelové infekce drůbeže, jako jsou S. enteritidis infekce. V následující diskusi jsou předloženy údaje o imunitě u myší protože tu chápeme nejlépe a následují dostupné údaje o imunitě drůbeže.
Je obecně akceptováno, že buněčná imunita je důležitější než humorální při ochraně proti salmonele ačkoliv většina těchto studií pochází z infekcí S. typhimurium u myší kde je vytvářena typická tyfu podobná infekce, ale jak dalece to platí pro kolonizaci střeva bez onemocnění není zatím jasné. Th1 cytokiny, které zvyšují buněčnou reakci, jsou rozhodující pro protektivní imunitu vůči primární salmonelové infekci. Důkaz o důležitosti Th1 reakce pochází z pokusů používajících myši, které vyřazují IFN-g receptor („knock out mice“) a myši s neutralizačními protilátkami k IL-2, které nejsou schopné rozlišit infekci atenuovaným kmenem salmonely, na rozdíl od myší, které postrádají T buňky omezené na třídu I, gd T buňky nebo B buňky produkující Ig, které jsou schopné zbavit se infekce. Kromě toho, u myší byla tyfoidní, protektivní úloha ukázána u IL-1a, TNFa, IFN-g, IL-12, IL-18 a IL-15, zatímco IL-4 a IL-10 inhibují obranu hostitele proti salmonele, což opět ukazuje důležitost Th 1 odpovědi při kontrole salmonely. U myší vyřazujících Igm, které postrádaly B-lymfocyty se ukázalo, že kontrola primární infekce avirulentními vakcinačními kmeny salmonely závisí striktně na CD4+ T-buňkách produkujících IFN-g, zatímco vakcínou navozená ochrana proti infekci zahrnovala obojí, buněčnou i humorální reakci; humorální reakci v pozdějších fázích infekce. Buněčná i humorální imunitní odpověď je stimulovaná intraperitoneálně aplikovanými horkem usmrcenými a živými salmonelovými vakcínami u myší. Rozdíl je ve stimulaci Th1 nebo Th2 odpovědi, při které jsou buď B buňky nasměrovány, aby se přepnuly na IgG2a cestou stimulace Th2/IL-4 živým organismem nebo aby se přepnuly na IgG1 po stimulaci Th1 buňkami produkujícími IFN pomocí usmrcených salmonel. Zjistilo se, že IFN-g jsou nezbytné pro druhem zprostředkované usmrcení virulentních salmonel reaktivním kyslíkem, ačkoliv nejsou nezbytné pro usmrcení avirulentních vakcinačních kmenů.
Jen málo toho víme o imunitní odpovědi na virulentní a atenuované kmeny salmonel u drůbeže na rozdíl od myší. Nemůžeme zhodnotit úlohu Th1 ve vztahu k Th2 imunitní odpovědi protože dosud nebyly publikované studie, které by se zabývaly Th2 cytokiny. Ale byla ukázána důležitá úloha ranných CD8+ T buněk jako reprezentativní populace buněčné imunity u mladých kuřat po primární infekci salmonelou. Má se za to, že buněčná imunita je důležitější než humorální pro odstranění virulentních kmenů z tkáni u drůbeže, zatímco IgA odpověď a polymorfonukleární leukocyty se zdají být klíčovými prvky při odstraňování salmonely ze střeva ačkoliv to nebylo dokázáno experimentálně a důkazy jsou zavádějící. Odstraňování S. typhimurium infekce u kuřat koreluje s e silnou buněčnou odpovědí (hypersenzitivní reakce opožděného typu) a ne s vysokou hladinou protilátek. Naopak, studie Desmidta a kol. (1998b) s kuřaty infikovanými S. enteritidis a vyříznutou burzou ukázala, že u kuřat s depletovanými B-buňkami je zvýšené vylučování salmonel výkaly a vyšší počet salmonel ve střevě, zatímco ve vnitřních orgánech je počet zárodků normální, což ukazuje protektivní účinek IgA vůči střevní kolonizaci. Kolonizace jater a sleziny v průběhu doby poklesla u kontrolních zvířat i u těch s burzektomií, což naznačuje, že jiné imunitní mechanismy hrají úlohu při systémovém odstranění S. enteritidis u kuřat. Důležitost buněčných imunitních mechanismů při systémovém odstraňování S. enteritidis u kuřat nedávno zkoumal Farnell a kol. V naší studii intraperitoneální aplikace rekombinantní IFN-g způsobila snížení kolonizace orgánů po orální infekci S. enteritidis.
Dále bylo u myší zjištěno, že polymorfonukleární buňky hrají důležitou roli při rezistenci vůči salmonelovým infekcím. U kuřat se heterofilní granulocyty akumulují v „propria mucosae“ střeva v průběhu 18 hod po experimentální infekci polním kmenem S. enteritidis. U infekcí S. typhimurium je to doprovázeno akutní enteropatogenní reakcí vyznačující se expresí CXC chemokinů a přílivem PMN. Jako reakci na S. enteritidis heterofily regulují směrem nahoru expresi mRNA u prozánětlivých chemokinů IL-6 a IL-8 stejně jako u protizánětlivého cytokinu TGF-beta 4, zatímco exprese IL-18 a IFN g byla regulována směrem dolů. Bakteriální faktory, které jsou zodpovědné za tento účinek nebyly úplně vysvětleny, ale zdá se, že u myší zahrnují sekretované efektorové proteiny jako je SopA, B a D a flagella protein FliC a možná FliB. Avšak objevují se rozdíly u různých sérovarů neboť aviární tyfoidní sérovar S. gallinarum reguluje směrem dolů indukci IL-1 a IL-6 u aviárních epiteliálních buněk. Probíhala rozsáhlá diskuse o přispění PMN přílivu k enteropatogenitě, ale nyní máme důkaz, že toto přispění není přímé.
Granulocytopenická (s vyčerpáním heterofilů) kuřata jsou mnohem více náchylná na orgánovou invazi S. enteritidis přičemž počet bakterií ve vnitřních orgánech je v poměrném vztahu k poklesu počtu cirkulujících PMNs. Dalším výsledkem, který zdůrazňuje důležitost kuřecích heterofilů při ochraně vůči napadení orgánů salmonelou byl nález, že intraperitoneální aplikace S. enteritidis imunních lymfokinů (SE-ILK) 18 týdenním kuřatům ochránila tato zvířata před napadením orgánů S. enteritidis. SE-ILK jsou rozpustné produkty vytvářené T-lymfocyty, odvozené od S. enteritidis-imunních slepic, kultivovaných za přítomnosti concanavalinu A. Intraperitoneální aplikace SE-ILK kuřatům způsobila dramatické zvýšení počtu heterofilních granulocytů v pobřišnici beze změny počtu ostatních leukocytů a aplikace in ovo ochránila mladá kuřata před napadením orgánů salmonelami. U kuřat s heterofilní deplecí byla zjištěna těžká morbidita a mortalita po perorální inokulaci normální subletální dávky S. enteritidis, což jen podtrhuje důležitost heterofilních granulocytů. Tato studie ukazuje nejen důležitost tohoto aspektu při vrozené odpovědi na salmonelovou infekci, ale také naznačuje, že průběh infekcí by mohl být změněn manipulací těchto odpovědí.
Vakcíny a adaptivní imunita
Vakcinace proti hostitelsky specifickým sérotypům salmonel způsobujícím závažná systémová onemocnění u jednotlivých hostitelských druhů (S. gallinarum u drůbeže) indukuje silnou sérotypově specifickou protektivní imunitu k infekcím a nemocem. Naopak, vakcinace proti nespecifickým sérotypům salmonel měla různou míru úspěchu. Tyto dva infekční typy ukazují velmi rozdílný epidemiologický obraz a model patogenity, který spolu s charakterem imunitní odpovědi k systémovým a střevním infekcím může vysvětlovat tyto rozdíly. Hostitelsky specifické sérotypy způsobují systémové onemocnění se zapojením monocyto-makrofágové řady a obecně malou počáteční kolonizací střeva, zatímco opak je pravdou u většiny sérovarů , které jsou spojené se vstupem do potravního řetězce lidí a způsobují otravu potravin.
Účinnost vakcín je hodnocena na základě hladiny střevní a systémové kolonizace a testuje se stupeň morbidity a mortality po vakcinaci a experimentální infekci perorální a parenterální cestou. Avšak míra protekce závisí na challengním kmeni, způsobu aplikace, infekční dávce, věku drůbeže a její linii /druhu. Striktní srovnání účinnosti dostupných vakcín je těžké.
Vakcinace proti hostitelsky nespecifickým sérotypům salmonel měla kolísavý úspěch. Zájem veřejnosti způsobil, že to po mnoho let byla úspěšná oblast výzkumu. Objevilo se mnoho přehledů, které shrnují naše znalosti a chápání této problematiky za poslední 3-4 roky. Na tomto místě není vhodné uvádět podobný souhrn, ale raději prozkoumáme současnou literaturu a uděláme si přehled o názorech na použití různých typů vakcín u drůbeže, což bude mít určitou relevanci s jejich použitím u ostatních potravních zvířat a budeme se zabývat důsledky použití vakcín u mladých zvířat, aby se využilo raných účinků zahrnutých do tohoto přehledu.
Inaktivované vakcíny se používají ke kontrole hostitelsky nespecifických salmonelových infekcí u drůbeže s velice rozdílným úspěchem. Používají se velké míře jako autologové vakcíny a o jejich účinnosti existuje jen málo informací. Nedávné práce (Timms et al., 1994; Liu et al., 2001) podporují dřívější pozorování, že mohou být využity k redukci mortality, ačkoliv to má jen malý praktický význam v terénu. Významnost tohoto snížení mortality pro kolonizace orgánů a vylučování také není zcela jasná neboť salmonelová infekce je v terénu většinou asymptomatická. Jsou hlášeny různé účinky inaktivovaných vakcín na vylučování výkaly a kolonizaci střeva a vnitřních orgánů. Některé práce podporují dřívější názor, že vakcinace matek bakterinem neredukuje významně vylučování salmonel u potomstva, ačkoliv mortalita se může snížit. Byly však také zaznamenány pozitivní výsledky. Jedna dávka perorální nebo intramuskulární imunizace bakteriemi S. enteritidis inaktivovanými formalinem, zapouzdřenými v biodegradovatelných mikrosférách aplikovaná ve věku 2 týdnů snížila vylučování výkaly a kolonizaci orgánů S. enteritidis po perorální infekci s 109 CFU v 6 týdnech věku. Intravaginální vakcinace olejovou emulzí bakterinu S. enteritidis ve věku 38 týdnů následovaná booster dávkou o 4 týdny později snížila kolonizaci vaječníků a sleziny a snížila vylučování challengního kmene S. enteritidis výkaly. Po challengi bylo 36 ze 189 vajec (19,0%) u vakcinovaných slepic pozitivních a tato míra kontaminace byla signifikantně nižší než u nevakcinovaných slepic )61 ze 165 vajec, t.j. 37,0%). V porovnání s tím bylo v polním pokusu byl autogenní bakterin použit pro jednu nebo dvojitou imunizaci, kdy deset hejn nosnic bylo vakcinováno v různých časových intervalech, zatímco jedno hejno zůstalo nevakcinované. Procento pozitivních vzorků prostředí a vzorků vnitřních orgánů vakcinovaných zvířat se nesnížilo ve srovnání se zvířaty z nevakcinovaných hejn.
Na trhu v některých evropských zemích je k dostání vakcína obsahující inaktivovanou S. enteritidis, která byla kultivována za podmínek s omezeným obsahem železa. Také vakcína obsahující S. enteritidis stejně jako S. typhimurium, kultivované za podmínek s omezením železa, je komerčně dostupná. Je známé, že omezení železa reguluje směrem nahoru bakteriální faktory tak, že stimuluje virulenci a tím může stimulovat důležité imunogeny. Avšak za předpokladu, že příslušné geny nejsou regulovány směrem nahoru u makrofágů, bylo by vhodnější produkovat vakcínu za podmínek příslušných tomuto prostředí. Vakcína z inaktivované S. enteritidis byla účinná při snižování kontaminace vajec po intravenózni challengi S. enteritidis. Tato práce se těžko hodnotí a perorální challenge by byla relevantnější. Ale kombinovaná vakcína S. enteritidis a S. typhimurium aplikovaná intramuskulárně 1. a 4. den snížila vylučování po perorální challengi S. typhimurium. Méně než 30% vakcinovaných ptáků vylučovalo bakterie salmonely, zatímco 10 dní po challengi více než 80% nevakcinovaných ptáků vylučovalo salmonelu.
Subjednotkové vakcíny se také používají u drůbeže. Vakcíny s vnějším membránovým proteinem s adjuvans se také používají ke snížení vylučování S. enteritidis u drůbeže. Khan a kol. (2003) imunizoval devítitýdenní kuřata subkutáně dvěma vnějšími membránovými proteiny po nichž následovaly dvě boost imunizace s intervalem dva týdny. Ukázalo se, že tyto vnější membránové proteiny se zúčastní přichycení S. enteritidis k buněčným liniím střevního epitelu. Imunizace jakéhokoliv vnějšího membránového proteinu snížila kolonizaci v céku asi 1000x když byla zvířata imunizována 8x108 CFU virulentního kmene S. enteritidis.
Pozornost se soustřeďuje na vývoj avirulentních vakcinačních kmenů salmonely protože se množí důkazy, že takovéto salmonelové kmeny jsou více imunogenní u myší a drůbeže než jsou inaktivované nebo subjednotkové vakcíny. Živé vakcíny se intenzívně testují u myší, ale i u drůbeže. Ačkoliv se množství různých živých salmonelových kmenů testuje na účinnost v poloprovozních pokusech, jen málo z nich je zaregistrovaných a komerčně dostupných pro použití u drůbeže v Evropě. Komerčně dostupné živé vakcinační kmeny Salmonella typhimurium a Salmonella enteritidis jsou buď auxotrofní mutanty s dvojitým markerem odvozené pomocí chemické mutageneze nebo vyvinuté na základě principu metabolických driftových mutací. Jedná se o negativní mutace u esenciálních enzymů a metabolických regulačních centrech, které mají za následek, že výsledné metabolické procesy vedou k prodloužení generační doby a odpovídajícímu snížení virulence. Některé z těchto živých salmonelových vakcín jsou dále charakterizovány pomocí molekulárních metod.
Další živou vakcínou zaregistrovanou pro profylaktické účely proti S. enteritidis (která byla původně vyvinuta proti S. gallinarum) je hrubý kmen S. gallinarum íR. tento vakcinační kmen se v posledních letech intenzívně testoval, protože se ukázalo, že poskytuje zkříženou ochranu proti S. enteritidis, t.j. členovi stejné séroskupiny. Rozsah zkřížené ochrany proti jiným sérotypům, buď ze stejné nebo jiné séroskupiny, zůstává zatím neobjasněný. Ve velkých terénních pokusech v Holandsku při kterých bylo 80 komerčních hejn vakcinováno vakcinačním kmenem S. gallinarum 9R byl výskyt S. enteritidis infekce na úrovni hejna 2,5% (2/80 hejn). To bylo průkazně méně než u nevakcinovaných hejn (214 z 1854 hejn nebo 11,5%). U 4500 vajec z 5 hejn vakcinovaných S. gallinarum 9R nebyly zjištěny žádné bakterie vakcinačního kmene a v jiné studii nebyl zjištěný žádný důkaz o šíření vakcinačního kmene výkaly.
Jako vakcinační kmeny pro drůbež byly také testovány spontánní mutanti S. enteritidis, citliví na teplotu a schopní růst dobře při 28°C, ale ne při 37°C. Když byl mutant naočkován orální cestou (109 CFU) kuřatům 1, 2, 3 a 7 dní po vylíhnutí a tato kuřata byla challengována perorálně 7 nebo 14 dní po poslední vakcinaci dávkou 108 CFU S. enteritidis a S. typhimurium, bylo získáno méně bakterií z obsahu céka, z jater a sleziny 14 dní po challengi. Při alternativním vakcinačním schématu (108 CFU 1. den a 2 týdny po vylíhnutí perorálně) se také snížilo vylučování a kolonizace vnitřních orgánů když byla zvířata challengována s 109 CFU virulentního kmene S. enteritidis 14 dní po poslední perorální imunizaci. Stejně jako u mnoha jiných studií, k challengi došlo brzo po vakcinaci a vakcinační kmen byl stále ještě přítomný ve tkáních u 54 a 28% zvířat v době vakcinace. Takovéto experimenty mohou být částečně vysvětleny nespecifickými efekty o kterých je zmínka dále v této studii a všechny práce, které zahrnují krátkou dobu mezi vakcinací a challengí musí brát v úvahu stimulaci vrozené odpovědi.
Vyvíjí se množství dalších živých atenuovaných salmonelových vakcinačních kmenů pomocí mutace genů, které se podílejí na přežití v tkáních hostitele. Genetická modifikace vakcinačního kmene má za cíl snížení rizika šíření nebo přežívání v prostředí a současně indukci adaptivní imunitní odpovědi. Bude zřejmé, že některé z vybraných mutací mohou být důležité pro inhibici kolonizace, kterou budou schopné navodit ve střevě mladých zvířat. Kompletní genom S. typhimurium byl sekvenován (www.genome.wustl.edu/projects/bacterial/styphimurium) a genom S. enteritidis je nyní také kompletní (www. sanger.ac.uk/projects/Salmonella). To usnadní konstrukci zcela racionálních mutací. Geny kódující metabolické funkce nebo faktory virulence jsou hlavním cílem při produkci bezpečných vakcinačních kmenů. Existuje určité odůvodnění pro inaktivaci domácích genů což sníží růst bakterií a virulenci bez většího ovlivnění exprese klíčových determinant virulence, které jsou nutné pro správnou imunogenicitu. Mohou být zavedeny dvojité nebo trojité mutace, aby se zvýšila bezpečnost , tím, že se sníží riziko reverze akvizicí genů horizontálním transferem. Ať se provádí jakákoliv mutace, je důležité, aby si vakcinační kmen podržel schopnost agresívnosti, aby mohl stimulovat dostatečnou protektivní imunitu. Současně ale vakcinační kmen potřebuje být eliminován před porážkou brojlerů a před počátkem snášky u nosných nebo chovných kuřat. Mnoho genů bylo mutováno kvůli konstrukci zkoušených vakcín, včetně těch, které se podílejí na biosyntéze bakteriálního lipopolysacharidu (galE), regulaci exprese vnějších membránových proteinů (ompR), aminokyselin nebo biosyntéze purinu (např. aro, pur, guaB), regulaci využití zdroje uhlíku (cyacrp), faktorech virulence a mnoha dalších, jako jsou htrA, phoPQ, recA a waaN. Jen málo mutantů bylo testováno u drůbeže, ale relevance studií na myších pro drůbež je diskutabilní. Například phoPc mutanti S. typhimurium špatně prezentují antigeny in vitro, ale u myší jsou vysoce imunogenní, což je z velké části připisované účinné prezentaci dendritickými buňkami na rozdíl od špatného přežívání v makrofázích. Jak dobře takové kmeny přežívají v kuřecích buňkách se vůbec neví. AroA mutanti se intenzívně testují u drůbeže a zjistilo se, že jsou účinní, i když méně protektivní než „zlaté standardy“ produkované u kuřat, které byly infikované kmenem divokého typu. Když se shodneme, že existuje jen malá zkřížená ochrana mezi sérovary, potom nás nepřekvapí, že Parker a kol. (2001) nenalezl průkazné rozdíly v infekci vajec nebo rozmnožovacího ústrojí když byly nosnice vakcinovány v den líhně, ve stáří 4 a 22 týdnů aroA mutantem S. typhimurium a challengovány S. enteritidis 8 týdnů po finální imunizaci.
Mnohé vlastnosti, které jsou připisovány cya crp mutantu S. typhimurium, včetně vysoké hladiny zkřížené ochrany vyžadují potvrzení a mutant si ponechává značnou virulenci u gnotobiotických prasat. Také Dueger a kol (2003) tvrdili, že se jedná o zkříženou ochranu u samic – mutantů, ačkoliv míra ochrany byla značně malá. Tyto studie také podtrhují nedostatky mutací, které demonstrují atenuaci systémovách onemocnění, ale nejsou testovány na schopnost indukovat gastroenteritidu. Zkoumání sop a ostatních genů spojených se Sip-dependentními efektorovými proteiny je logickým dalším stadiem při konstrukci opravdu racionálních vakcín.
Využití živých atenuovaných salmonelových kmenů k dodání rekombinantních antigenů imunitnímu systému je atraktivní další strategie při konstrukci multivalentních vakcín u drůbeže. Multivalentní vakcíny by snížily počet vakcinací v terénu. Hlavním úkolem při vývoji salmonelových rekombinantních vakcín je zachování (udržení) exprese heterologního antigenu v tkáních v imunogenní formě v hladinách dostatečných pro senzibilizaci protektivní imunitní odpovědi. Vakcinace kuřat s D cya crp mutantem S. typhimurium projevující E. coli O78 LPS O- antigeny indukovala protilátky proti O78 LPS O-antigenu a proti salmonele a přinesla určitý stupeň ochrany proti challengi patogenním kmenem E. coli O78. Vakcinační kmeny S. typhimurium už byly použity jako systém dodávající antigen při orální imunizaci kuřat proti dvěma antigenům kokcidiového parazitu Eimeria tenella. Avšak dodání antigenů imunitnímu systému není samo dostačující k vytvoření imunitní odpovědi. Úspěšná vakcinace vyžaduje také vyvolání správného typu imunitní odpovědi. Proto různé skupiny pracují na vývoji vakcinační strategie založené na nosičích, aby se podpořila optimální imunitní odpověď. Například kmeny které nesou mutace ovlivňující specifický průběh infekce mohou být využity k modifikaci vyvolané imunitní odpovědi nebo subcelulární umístění rekombinantního antigenu ve vakcinačním salmonelovém kmeni může ovlivnit typ imunitní odpovědi. Kromě toho, současné dodání molekul stimulujících imunitu usnadňuje spuštění předvídatelné odpovědi podle specifické potřeby. Tento typ studií byl až dosud prováděn pouze u myší. Např. Igwe a kol. zkonstruovali chimérový protein založený na Yersiniovém vnějším proteinu E (YopE), který zahrnuje listériové antigeny vyvolávající buněčnou imunitní odezvu. U myší imunizovaných orálně atenuovanými salmonelovými vakcinačními kmeny s expresí chimérového YopE translokovaného sekrečním systémem III vedla tato nová vakcinační strategie k indukci silné cytotoxické CD8 T buněčné odpovědi, která navodila určitou protektivní imunitu.
Ve vývoji v několika posledních letech je důležité použití salmonelových vakcín pro dodání DNA vakcín. Takové vakcíny mohou indukovat imunitu vůči salmonelovým nosičům, heterologním antigenům z druhého sérotypu salmonely nebo jiným patogenům. Bere se v úvahu budoucí modulace imunitní odpovědi koexpresí cytokinů. U salmonelových vakcinačních kmenů je exprese mnoha cytokinů a ukázalo se, že některé z nich mají imunomodulační účinky, přinejmenším u myší.
Živé vakcíny versus inaktivované
Jak již bylo řečeno, většina údajů o ochraně indukované vakcínami byla získána ze studií na myších proto bychom měli být opatrní při použití těchto údajů pro drůbež. Inaktivované vakcíny mohou být účinné při redukci salmonel u drůbeže. Přesto se má za to, že živé vakcíny mají větší výhody než inaktivované, včetně stimulace buněčné i humorální imunity a exprese všech příslušných antigenů in vivo, zatímco inaktivované vakcíny stimulují hlavně produkci protilátek a umožňují expresi pouze u těch antigenů, které jsou přítomny v době“sklizně“ in vitro. Inaktivované vakcíny mohou také být rychle zničeny a eliminovány z hostitele, mohou být jen málo imunogenní u neprimovaných hostitelů a neschopné indukovat cytotoxické T buňky. Ukázalo se, že živé vakcíny jsou účinnější při zvyšování proliferace lymfocytů jako odpověď na antigeny S.enteritidis u nosnic. Mají také přídavné protektivní účinky, zvláště při parenterální aplikaci, což může být využito při jejich vývoji a aplikaci. Zahrnuje to rodově-specifickou inhibici kolonizace (kompetitivní exkluzi) což je především účinek mikrobiálního metabolismu a situace primovaných PMNs ve střevě (viz dále). Inaktivované vakcíny nejsou schopné indukovat takovéto účinky. V současné době se zdá nepravděpodobné, že účinnější inaktivované nebo subjednotkové vakcíny se budou vyrábět během několika málo příštích let, protože mnoho základních otázek spojených s identifikací hlavních protektivních imunogenů a povahou imunitní odpovědi u kuřat zůstává nezodpovězených. Živé vakcíny mají některé nedostatky, z nich nejdůležitější jsou asi ty spojené s akceptováním veřejností. Je to důležitá otázka, které bychom se měli věnovat, protože požadavky na bezpečnost se liší u živých a inaktivovaných vakcín.
Kritérii pro ideální vakcínu jsme se zabývali již dříve a zahrnují (1) účinnou ochranu proti slizniční i systémové infekci, (2) atenuaci (zeslabení) pro zvířata a člověka, (3) účinnou redukci kolonizace střeva a následně sníženou kontaminaci prostředí a infekci vajec, (4) kompatibilitu s ostatními kontrolními opatřeními a (5) rentabilní aplikaci. Jak bylo naznačeno již je možné atenuovat kmeny různými způsoby, ale neschopnost způsobit gastroenteritidu není vždy hodnocena. V příštích letech by mělo být možné produkovat živé, atenuované kmeny, které jsou imunogenní pro drůbež a ostatní potravinová zvířata, ale které si uchovávají atenuaci u člověka a ostatních necílových druhů. Nástrojem k dosažení tohoto cíle bude nezbytně molekulární genetika. Alternativou je, že se budou vyrábět živé, atenuované vakcíny tak jako nyní, nedefinovatelnou chemickou mutagenezí kmenů vlastnících kombinaci necharakterizovaných lézí, u kterých známe pouze jejich kumulativní účinky. Vakcíny, které se běžně používají v Evropě a jinde jsou vysoce bezpečné, ale je nezvyklé akceptovat jejich široké rozšíření zatímco jsme příliš opatrní při používání mutantů s definovanými delecemi vytvořenými genetickou manipulací kde však je každá delece známá a charakterizovaná. Environmentální problémy spojené s genetickou modifikací rostlin a také některých potravních zvířat, která se mohou dostat do volné přírody se velmi liší od problémů spojených s použitím delečních mutantů bez dodatečného přidání DNA. Výhodou těchto dnes široce užívaných vakcín je, že se shromažďují údaje o jakékoliv reverzi a jiném potenciálním riziku pro člověka, cílová zvířata a životní prostředí.
Kolonizace – inhibice
Vakcinace se považuje za základní profylaktické opatření jehož protektivní účinek začíná po dozrání odpovědi B a T buněk. Proto po vakcinaci jednodenních kuřat trvá produkce dostatečného množství protilátkové odpovědi proti salmonele více než 10 dní. Pro infekce, které se mohou objevit během této doby, jako jsou např. infekce z líhně, je toto období citlivosti příliš dlouhé. Ale perorálně aplikované živé salmonelové organismy mohou indukovat velmi rychlou formu ochrany v časném období života u drůbeže jako výsledek jejich kolonizačně – inhibiční činnosti.
Kolonizace – inhibice nebo jak se častěji říká kompetitivní exkluze mohou také být navozeny podáním preparátů s normální střevní flórou nově vylíhlým kuřatům. Mladí ptáci jsou velmi citliví k salmonelové infekci jako následek absence protektivní střevní flóry a nezralosti imunitního systému. Tato absence může být nahrazena aplikací produktů kompetitivní exkluze (CE), které jsou založeny na kulturách normální flóry získané od dospělých ptáků prostých patogenů. Podle doporučení WHO by tyto produkty by měly být aplikovány co možná nejdříve, už jednodenním kuřatům v líhni nebo sprejováním vajec čemuž se dává přednost před aplikací do první pitné vody. Ale ošetření nedefinovanou flórou není v mnoha zemích dovolené kvůli potenciálnímu riziku přenosu patogenů. Tomu se ale dá vyhnou řádným testováním produktu. Použití nedefinované flóry a probiotik při kontrole salmonelózy u drůbeže nebude v tomto přehledu probíráno do hloubky.
Kvůli zájmu týkajícímu se použití nedefinovaných CE produktů byly v 80 letech prováděny studie, které hledaly bakteriální kmeny, které vlastnily kolonizační vlastnosti salmonely, ale bez atributů virulence. Během této studie byla nalezena skupina jednodenních kuřat, která byla zcela odolná k infekci challengi kmenem S. typhimurium. Byl to výsledek toho, že se ptáci infikovali kmenem S. montevideo z krmiva brzo po vylíhnutí. Tento kmen, který byl izolovaný z ptáků a aplikovaný nové dávce vylíhlých kuřat je plně ochránil 24 hod později vůči challengi S. typhimurium. Bylo zjištěno, že tento atenuovaný nebezpečný mutant kmene S. typhimurium je také ochránil před kolonizací plně virulentním rodičovským kmenem. Proto byl tento účinek dále studován. Počáteční studie ukázaly, že tento účinek vyžaduje živé bakterie. Inaktivované preparáty aplikované buď perorálně nebo parenterálně neměly žádný účinek. Inhibice tedy nebyla výsledkem nové rychlé imunitní odpovědi stimulované bakteriálními antigeny ve střevě. Ani to nebyl výsledek bakteriofágové aktivity. Bylo to specifické pro příbuzné bakteriální taxony. Tak kmeny E. coli, Citrobacter, Proteus a jiné neměly žádná vliv na salmonelu, ale inhibovaly kolonizaci organizmů svých vlastních rodů. Mezi salmonelami nebyly všechny kmeny stejně inhibiční. Tento mechanismus byl studován pomocí in vitro systému bujónových kultur ve stacionární fázi. praktické aspekty tohoto účinku však byly okamžitě zřejmé a vyžadovaly další zkoumání. To ukázalo, že protektivní účinek vyžadoval vysoký počet bakterií ve střevě a že normální mikroflóra začala vyvíjet rodově specifickou exkluzi se sníženou účinností. Účinky byly dlouhodobé pokud se týká redukovaného vylučování výkaly a objevily se u různých plemen kuřat, kachen a při různém krmení. Účinek byl zřejmý po 6 hod nebo tak nějak, ale plně efektivní byl až za 18-24 hod. Některé kmeny byly účinnější než jiné, ačkoliv žádný z kmenů nebyl plně účinný proti kmenům salmonely a zdálo se, že je zde sérotypově specifický účinek, ale jak dalece to má vztah ke klonalitě spíše než k sérotypové specifičnosti zůstává zatím nejasné. Nejvíce intenzivní hladina inhibice in vivo se objevila mezi isogenními kmeny. Fakt, že challengní kmeny nekolonizovaly vedl také k jejich snížené invazi a s tím spojené mortalitě. Tyto údaje ukazují, že by bylo možné aplikovat čerstvě vylíhlým kuřatům živé vakcinační kmeny, tak aby intenzívně a rychle kolonizovaly střevo ještě předtím než se objeví normální mikroflóra, což by mělo indukovat silnou rezistenci ke kolonizaci kmeny, které se mohou vyskytovat v drůbežárně nebo se mohou objevit v líhni. Hledal se kmen salmonely se širokým spektrem inhibice, který je schopný zabránit kolonizaci značným množstvím kmenů. Zjistilo se, že kmen S. infantis a kmen S. hadar jsou více inhibiční než ostatní sérovary. Charakteristické pro tyto sérovary je, že jsou špatně invazivní, ale vysoce kolonizující a tato druhá vlastnost má vztah k inhibiční aktivitě, pravděpodobně pomocí široké škály dostupných živin (viz dále mechanismus inhibice).
Atenuované živé vakcíny Salmonella typhimurium a enteritidis s určitými mutacemi metabolické cesty nebo delecemi v genech pro cya a crp jsou imunogenní. Avšak bylo také ukázáno, že tyto atenuované, živé salmonelové vakcíny nebyly obecně schopné nebo jen slabě schopné inhibovat intestinální kolonizaci heterologními nebo homologními salmonelovými challengními organismy. Takže žádná z běžně dostupných komerčních živých salmonelových vakcín není schopná indukovat ochranu proti salmonelovým organismům touto exkluzí nebo inhibičním účinkem. Proto potřebujeme identifikovat živé salmonelové kmeny, které jsou dostatečně atenuované bez toho, že by se ovlivnily geny, které jsou důležité pro inhibici kolonizace. Nedávné studie potvrdily nejen vysokou hladinu atenuace salmonelových kmenů s delecemi u phoP, ale také demonstrovaly jejich kolonizačně-inhibiční schopnost.
Podobné kolonizačně inhibiční účinky byly také pozorovány ve střevech gnotobiotických (udržovaných ve sterilním prostředí) prasat což ukazuje, že je to obecný jev, neomezený jen na kuřata. Výskyt konkurence mezi příbuznými bakteriemi a její využití při prevenci infekce je ve skutečnosti známé již mnoho let, ačkoliv v mnoha případech nerozumíme její podstatě. Tato konkurence byla demonstrována mezi kmeny E. coli u gnotobiotických myší a nově narozených dětí a mezi enterotoxickými E. coli u prasat. Podobné studie s CE byli předvedeny u kmenů C. jejuni a provádějí se studie, které mají určit jestli je mechanismus podobný u Salmonella a Campylobacter.
Mechanismus kolonizace – inhibice také zatím moc nechápeme a ačkoliv dřívější hypotézy vyvstaly z pozorování, že podobná inhibice by mohla být demonstrována na bujónových kulturách ve stacionární fázi, interakcím s hostitelem ať už konkurencí na místa adheze nebo stimulací vrozeného imunitního systému rozhodně nebyl přikládán význam. Žádné z těchto mechanistických vysvětlení nevysvětluje úplně jev kolonizace – inhibice.
Odpověď hostitele při kolonizaci – inhibici: úloha granulocytů?
Z výše zmíněných experimentálních studií vzešel argument do jaké míry byl inhibiční účinek primárně mikrobiologickým procesem nebo konkurencí mezi příbuznými bakteriemi nezahrnující odpověď hostitele per se. Ale další studie z nedávné doby ukazují, že se na tom hostitel možná podílí a otevírají oblast infekčně – imunní biologie, která má značné praktické důsledky.
Protože kolonizace – inhibice je proces, který rychle navozuje rezistenci k infekci, předpokládá se, že adaptivní imunitní odpovědi nehrají důležitou roli. Je však známo,, že buňky imunitního systému jsou velmi rychle přitahovány k místu infekce po imunizaci kuřat virulentními a atenuovaným kmeny salmonely. Po orální imunizaci nově vylíhlých kuřat anteuovaným kmenem S. enteritidis aroA jsou imunitní buňky ve velkém počtu přitahovány k lamina propria v céku. Tyto buňky, které zahrnují heterofilní granulocyty, makrofágy, T-lymfocyty a v menší míře B-lymfocyty, infiltrují střevní stěnu během 24 hodin po vakcinaci , kdy až 25% střevní stěny může být t této době obsazeno těmito buňkami. Uvažuje se o tom, že tyto buňky by případně mohly hrát roli při kolonizaci – inhibici, neboť je známé, že céka jsou hlavním místem pro kolonizaci a invazi salmonelou u kuřat. Když byli ptáci perorálně vakcinováni 108 CFU kandidátským vakcinačním kmenem S. enteritidis aroA CVL30 okamžitě po vylíhnutí a následně challengovány virulentním homologním kmenem S. enteritidis o den později, kolonizace jater a sleziny byla silně redukovaná během prvních 5 dní po vakcinaci. Avšak 10 dní po infekci nebyl rozdíl v počtu challengních mikroorganismů v játrech a slezině u vakcinovaných a nevakcinovaných zvířat. Kolonizace céka challengním kmenem byla jen mírně potlačena i vakcinovaných zvířat ve srovnání s neošetřenou kontrolou. To ukazuje, že infiltrace buněk pravděpodobně nebyla hlavní příčinou kolonizace – inhibice ačkoliv to nebylo přesvědčivě dokázané, avšak demonstruje to zajímavý potenciál protektivního účinku proti virulentní salmonelové invazi brzo po vylíhnutí. Ten stejný pokus byl opakován u zvířat s deplecí heterofilních granulocytů pomocí modelu s 5-fluorouracil deplecí. V tomto experimentu se ochrana proti kolonizaci vnitřních orgánů úplně ztratila, což ukazuje, že heterofilní granulocyty hrají hlavní roli při ochraně proti invazi a kolonizaci orgánů. Tento nález souhlasí to s dřívějšími studiemi, které hodnotily úlohu heterofilních granulocytů při ochraně proti orgánové kolonizaci salmonelou. V této práci byl rozsah deplece heterofilních granulocytů úměrný zvýšení počtu salmonel ve vnitřních orgánech a zvýšení počtu cirkulujících heterofilních granulocytů po aplikaci cytokinů odvozených ze stimulovaných T buněk poskytlo ochranu proti orgánové kolonizaci salmonelou.Také mnohem starší práce ukázaly, že živé vakcíny mohou stimulovat v průběhu několika hodin po inokulaci vysoký stupeň protektivní imunity proti homologní a heterologní bakteriální challengi pravděpodobně aktivací /senzibilizací vrozeného imunitního systému, což měly být především makrofágy, ale pravděpodobnější je, že jsou to PMN.
Tyto údaje ukazují roli heterofilních granulocytů při ochraně proti kolonizaci vnitřních orgánů salmonelou u kuřat a také naznačují, že tuto protekci můžeme navodit orální inokulací živými atenuovanými salmonelovými vakcínami. To znamená značný praktický potenciál pro drůbež. Bakteriální faktory, které jsou zodpovědné za tento účinek nebyly ještě plně vysvětleny. Podobné výsledky byly zjištěny i u savců. Bylo zjištěno, že kmen S. infantis má široké spektrum kolonizační inhibice proti různým salmonelovým kmenům u nově vylíhlých kuřat. Tento kmen byl také testován u gnotobiotických prasat, aby se zjistilo, jestli je podobně inhibiční vůči jiným sérovarům u mladých savců krmených mlékem. Toto však nebylo zjištěno. Ačkoliv byl kmen S. infantis zcela avirulentní pro jednotýdenní prasata, nebyla zjištěna kolonizace – inhibice vůči plně virulentnímu kmenu S. typhimurium. Avšak prasata, která byla nejdříve inokulována S. infantis a challengována s S. typhimurium zůstala perfektně zdravá, zatímco prasata pouze inokulovaná S. typhimurium dostala silnou enteritidu a musela být utracena. Podobné výsledky byly zjištěny s druhým S. typhimurium challengním kmenem a S. choleraesuis a také když byly experimenty prováděny u gnotobiotických telat. Ze studovaných buněčných typů byly pouze polymorfonukleární buňky pozorovány u velkého počtu klků ve střevě vakcinovaných skupin. V další studii, kde byl detailně zkoumán tento účinek Foster a kol. zjistili, že kmeny S. infantis byly dostatečně invazivní, aby indukovaly infiltraci velkého množství primovaných neutrofilních granulocytů do střevní mukózy, které samy o sobě neindukovaly žádné patologické změny, ale byly vysoce antibakteriální k virulentnímu kmeni S. typhimurium, který byl inokulovaný o den později. Pre-inokulace atenouvanou salmonelou může účinkovat podobně s s komerčně dostupným Biostimem. Biostim je glykoprotein odvozený od Kleibsiella pneumoniae, u kterého bylo prokázáno, že redukuje trvání a objem bakteriální infekce v dýchacích cestách. Preparát stimuluje zvýšenou expresi C3b a C3Bi receptorů u neutrofilů, zvyšuje neutrofilní fagocytární kapacitu a zvyšuje neutrofilní oxidační metabolismus. Zdá se, že tyto tři mechanismy jsou oddělené a odlišné jevy, dva mikrobiologické a ten další zahrnuje vrozený imunitní systém, ale všechny mají praktický dopad pro použití živých vakcín u mladých zvířat včetně drůbeže.
