I. STEINHAUSEROVÁ, M. NEBOLA
Fakulta veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
Veterinářství 2002;52:63-65
SOUHRN
Steinhauserová I., Nebola M. Je drůbež nejčastější příčinou onemocnění kampylobakteriózou u člověka? Veterinářství 2002;52:63-65.
Celkem bylo vyšetřeno 302 kmenů Campylobacter jejuni; 121 humánních kmenů a 181 kmenů z drůbeže. Na základě restrikčního štěpení kombinací 3 enzymů (Afa I, MbO I a Hae III) bylo zjištěno 30 typů C. jejuni. U humánních kmenů bylo prokázáno 23 typů a u kmenů pocházejících z drůbeže 17 typů. U humánních kmenů se nejčastěji vyskytoval typ Cj. 4 (24 %), dále typy Cj. 1 (17 %), Cj. 13 (11 %), Cj. 15 (6 %) a Cj. 9 a Cj. 6 (každý 5 %). Ostatní typy se vyskytovaly u jednoho až pěti kmenů. U kmenů Campylobacter jejunipocházejících ze vzorků drůbeže se nejčastěji vyskytoval typ Cj. 1 (34 %), dále Cj. 21 (10 %), Cj. 9 (8 %) a Cj. 11 a Cj. 12 (každý 7 %). Ze získaných výsledků je zřejmé, že nejčastěji se vyskytující typ u humánních kmenů (Cj. 4) se vyskytoval pouze u 2 % drůbežích kmenů. Na druhé straně druhý nejčastější typ u humánních kmenů (Cj. 1) byl současně nejčastěji zastoupen i u kmenů pocházejících z drůbeže. Z ostatních častěji se vyskytujících typů Campylobacter jejunipocházejících od humánních pacientů nebyl prokázán u drůbeže žádný z nich, kromě typu Cj. 9. Naše zjištění i výsledky jiných autorů je potvrzují domněnku, že drůbež je významným zdrojem Campylobacter sp. pro člověka. Na druhé straně je celá řada i jiných zdrojů, které mohou být příčinou kampylobakteriózy člověka.
SUMMARY
Steinhauserová I., Nebola M. Is poultry the most frequent source of human campylobacteriosis? Veterinářství 2002;52:63-65.
Twenty-three and seventeen types were identified in sets 121 human and 181 avian Campylobacter jejuni isolates, respectively, examined by restriction digestion with a combination of the enzymes Afa I, MbO I, and Hae III. Type Cj 4 was identified in 24%, type Cj 1 in 17%, type Cj 13 in 11%, type Cj 15 in 6%, and types 9 and 6 in 5% of the human isolates. Each of the remaining types was identified in 5 or less strains. As for the avian strains, type Cj 1 was identified in 34%, type Cj 21 in 10%, type Cj 9 in 8%, and types Cj 11 and Cj 12 in 7% each of the isolates. Only 2% of the avian strains belonged to Cj 4 which was most frequently identified among the human strains. On the other hand, type Cj 1, which ranked second in the frequency order of the human strains (17%), was identified in 34% of the avian strains. Except for type Cj 9, none of the types identified in less than 6% of the human strains was found in the set of the avian strains. Our results, like those published by other authors, corroborate the assumption that poultry is a significant source of human infections by Campylobacter spp., although other sources must not be neglected.
Onemocnění kampylobakteriózou patří v řadě rozvojových i rozvinutých zemí mezi nejčetnější onemocnění z potravin. Rod Campylobacter zahrnuje řadu druhů, které mají rozdílné postavení z hlediska patogenity pro člověka. Nejčastější příčinou onemocnění člověka je C. jejuni, v menší míře pak C. coli. Byly popsány případy gastrointestinálních onemocnění člověka vyvolané C. lari a C. upsalensis. Uvedené druhy patří do skupiny termofilních kampylobakterů, tzn. že rostou při teplotách nad 37 °C. Ostatní druhy mají z epidemiologického hlediska jako původce onemocnění z potravin jen malý význam. Bývají izolovány např. z dutiny ústní při zánětech dásní, z abscesů, kožních lézí a mohou se uplatňovat u člověka jako oportunní patogeny. Přehled druhů, které již byly popsány jako příčina onemocnění u člověka, je uveden v tabulce I.
V České republice, kde na přelomu 90. a 80. let byla kampylobakteróza téměř neznámým onemocněním, bylo v roce 2000 evidováno téměř 17 tisíc případů onemocnění. Tento počet představuje incidenci asi 170 případů na 100 000 obyvatel. Onemocnění vyvolané Campylobacter sp. tak představuje po salmonelóze druhé nejčastěji se vyskytující alimentární onemocnění s každoročním výrazným nárůstem hlášených případů onemocnění. V České republice prakticky nejsou hlášeny rozsáhlejší epidemie způsobené Campylobacter sp. Naprostá většina onemocnění jsou sporadické případy, někdy s rodinným výskytem. Také pravidelné monitorování potravin nevede k četnějším nálezům Campylobacter sp.
Pravděpodobným důvodem nízkých nálezů Campylobacter sp. v potravinách je vysoká citlivost Campylobacter sp. v prostředí a prakticky neschopnost pomnožování v potravině. Campylobacter sp. může přežívat především v syrovém mase, mléce popř. ve vodě a při nevhodné manipulaci sekundárně kontaminovat již hotové potraviny. Přesný mechanismus šíření Campylobacter sp. v chovech zvířat, přenosu ze zvířat, resp. z potraviny na člověka je předmětem řady studií a není dosud spolehlivě vysvětlen. Na základě těchto poznatků je třeba stanovit opatření, kterými je možné šíření původce omezit nebo i zabránit. Vzhledem k tomu, že je pravděpodobné, že se jednotlivé kmeny liší patogenitou a virulencí, je nutné pro epidemiologické účely provádět typizaci kmenů Campylobacter sp. Běžné metody typizace, jako je serotypizace, fágová typizace a biotypizace, nejsou vhodné pro rutinní účely a nemají dostatečnou diskriminační hodnotu. Proto byly navrženy a v praxi vyzkoušeny různé způsoby typizace na základě genotypizace při využití molekulárních metod. V dnešní době existuje řada molekulárních metod s různou diskriminační silou, náročností na vybavení, časovou a finanční náročností na prováděné vyšetření. Mezi často používané metody patří i RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms). Tato metoda není náročná na přístrojové vybavení, je poměrně rychlá a levná, ale má poněkud nižší diskriminační hodnotu v porovnání např. s AFLP nebo PFGE. Cílem práce bylo provést pomocí RFLP typizaci kmenů Campylobacter jejuni izolovaných z poražené drůbeže a případů onemocnění člověka a pokusit se nalézt epidemiologické souvislosti.
Materiál a metodika
Bakteriální kmeny: Celkem bylo vyšetřeno 302 kmenů pocházející z drůbeže a člověka v období roku 2000 - 2001. Humánní kmeny Campylobacter jejuni byly izolovány z rektálních výtěrů od lidských pacientů s enteritidami. Jednalo se celkem o 121 suspektních kmenů, které byly získány ve spolupráci s firmou BioPlus a s Krajskou hygienickou stanicí v Brně. Kmeny pocházely od pacientů z moravských regionů. Dále bylo vyšetřeno 181 kmenů Campylobacter jejuni, jež byly izolovány ze vzorků v drůbežářském závodě. Porážená drůbež pocházela z různých chovů v rámci celé ČR. Byly vyšetřeny vzorky stěrů z vnějšího povrchu poražených kuřat před vykucháním, po vykuchání, povrchu po osprchování a vychlazení včetně vzorků jater a separovaného kuřecího masa. Vzorky byly transportovány v BHI bujónu s přídavkem CAT suplementu do laboratoře a ihned zpracovány.
Druhová identifikace byla prováděna pomocí následujících biochemických testů (dle ČSN ISO 10272): oxidázový test, test na přítomnost katalázy, test na hydrolýzu hippurátu, citlivost na kyselinu nalidixovou a cephalotin a test na produkci sirovodíku na TSI médiu. Současně s vyšetřovanými vzorky byly testovány referenční kmeny Campylobacter jejuni CCM 6212, Campylobacter jejuni ATCC 33291.
PCR– identifikace Campylobacter jejuni: Kmeny, které byly biochemicky určeny jako Campylobacter sp., byly testovány metodou PCR. Pro specifickou PCR identifikaci a diferenciaci termofilních Campylobacter sp. byly použity primery THERM1 a THERM4 specificky amplifikující polymorfní část genu pro 23S rRNA dlouhou 491 bp.1 Amplifikovaná DNA byla analyzována v 1,5% (w/v) agarózovém gelu, vizualizována barvením ethidium bromidem a jeho excitací pod UV zářením na transiluminátoru. Jako standard byl použit GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus.
Následující druhové rozlišení bylo provedeno digescí PCR produktu restrikčním enzymem Alu I a Tsp509I. Do PCR-FRLP reakčního mixu (20 µl) bylo použito 4 µl PCR produktu a 1 U restrikčního enzymu Alu I a Tsp509I.
PCR-RFLP – subtypizace Campylobacter jejuni: Kmeny, které byly předchozí PCR-RFLP určeny jako Campylobacter jejuni, byly testovány PCR-RFLP subtypizací. Pro specifickou PCR amplifikaci 702 bp dlouhého PCR produktu byly použity primery rozeznávající sekvenci flagelinového genu A (fla A). Sekvence primeru2 byla 5´- TACTACAGGAGTTCAAGCTT -3´ a reverzního primeru 5´- GTTGATGTAACTTGATTTTG –3´. Do PCR-FRLP reakčního mixu (20 µl) bylo použito 10 µl PCR produktu a 3 U restrikčního enzymu Afa I, MbO I a Hae III. Reakční mix byl inkubován při 37 °C 3 hodiny. Produkty štěpení byly analyzovány v 3% (w/v) NuSieve 3 : 1 agarózovém gelu. Jako standard byl použit GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus.
Výsledky a diskuse
Celkem bylo vyšetřeno 302 kmenů Campylobacter jejuni; 121 humánních kmenů a 181 kmenů z drůbeže. Na základě restrikčního štěpení kombinací tří enzymů (Afa I, MbO I a Hae III) bylo zjištěno 30 typů Campylobacter jejuni. U humánních kmenů bylo prokázáno 23 typů a u kmenů pocházejících z drůbeže 17 typů.
U humánních kmenů se nejčastěji vyskytoval typ Cj. 4 (24 %), dále typy Cj. 1 (17 %), Cj. 13 (11 %), Cj. 15 (6 %) a Cj. 9 a Cj. 6 (každý 5 %). Ostatní typy se vyskytovaly u jednoho až pěti kmenů.
U kmenů Campylobacter jejuni pocházejících ze vzorků drůbeže se nejčastěji vyskytoval typ Cj. 1 (31 %), dále Cj. 21 (10 %), Cj. 9 (8 %) a Cj. 11 a Cj. 12 (každý 7 %).
Ze získaných výsledků je zřejmé, že nejčastěji se vyskytující typ u humánních kmenů (Cj. 4) se vyskytoval pouze u 2 % drůbežích kmenů. Na druhé straně druhý nejčastější typ u humánních kmenů (Cj. 1) byl současně nejčastěji zastoupen i u kmenů pocházejících z drůbeže. Z ostatních častěji se vyskytujících typů Campylobacter jejuni pocházejících od humánních pacientů nebyl prokázán u drůbeže žádný z nich, kromě typu Cj. 9. Z 23 typů Campylobacter jejuni zjištěných u člověka bylo pouze 11 typů, které se v různé frekvenci vyskytovaly jak u člověka tak i u drůbeže. Druhý u kuřat nejčastěji se vyskytující typ Campylobacter jejuni (Cj. 21) nebyl v humánní populaci vůbec prokázán. Z celkem 17 typů Campylobacter jejuni zjištěných u kuřat se šest typů vyskytovalo pouze u kuřat a ne v humánní populaci. Naproti tomu z 23 typů humánních kmenů se 12 z nich vyskytovalo pouze u lidí a nebyly zjištěny u vzorků pocházejících z drůbeže.
Poměrně překvapující je nižší počet typů (17) izolovaných z drůbeže v porovnání s počtem typů (23) pocházejících z humánní populace. Přitom lidské kmeny byly izolovány od pacientů pocházejících pouze ze tří regionů. Naopak drůbež byla porážena z poměrně rozsáhlé nasávací oblasti. Současně při dnešní organizaci obchodu a pohybu potravin nelze předpokládat, že poražená drůbež je konzumována v místě porážky nebo v jejím blízkém okolí, ale je v rámci obchodní sítě prodávána prakticky v celé republice.
Byly srovnány výsledky práce autorů,2 kteří prováděli stejnou metodou typizaci kmenů Campylobacter jejuni pocházejících od pacientů s průjmy z Číny a Japonska. V této práci autoři prokázali 25 typů Campylobacter jejuni. Při vzájemném porovnání bylo u našich výsledků prokázáno u humánních i drůbežích kmenů 16 společných typů a 14 typů odlišných.
Je pravděpodobné, že různé kmeny C. jejuni mají odlišnou patogenitu pro drůbež a pro člověka a také různou schopnost osídlovat střevo hostitele. Při inokulaci 14denních kuřat humánními kmeny C. jejuni a C. coli bylo zjištěno,3 že všechny kmeny C. coli kolonizovaly střevo kuřat. Naproti tomu čtyři ze sedmi kmenů C. jejuni nebyly schopny střevo kuřat osídlit. Po opětované inokulaci kuřat těmito čtyřmi kmeny C. jejuni tři z nich opět nebyly schopny střevo kolonizovat. Současně byl zjištěn jeden kmen C. jejuni, který byl natolik dominantní, že vytlačil již ve střevě kolonizované kmeny C. jejuni a vytvořil společnou kolonizaci s kmeny C. coli.
Podobné výsledky publikovali autoři,4 kteří typizovali kmeny C. jejuni a C. coli pocházející z odpadních vod ze zpracoven drůbeže a z odpadních vod z domácností. Autoři zjistili, že z 22 profilů PCR/RFLP bylo šest typů běžně se vyskytujících ve všech typech odpadních vod. Byly však zjištěny profily, které se vyskytovaly pouze v odpadních vodách ze zpracoven drůbeže. Je tedy zřejmé, že u některých kmenů je omezená virulence a tyto kmeny nejsou patogenní pro člověka.
Souvislost mezi nálezy Campylobacter sp. u drůbeže a onemocněním člověka dokumentují i další výsledky.5 Autoři pomocí RFLP typizace zjistili, že některé kmeny izolované z kuřat, vzorků potravin a od pacientů s kampylobakteriozóu jsou identické. Stejné typy byly také nalezeny v prostředí snáškových hal.
Zdrojem Campylobacter sp. pro člověka není jen drůbež. Bylo zjištěno,6 že kmeny izolované od humánních pacientů byly identické nejen s kmeny pocházejícími z drůbeže, ale i s kmeny pocházejícími ze skotu. Podobně byly prokázány epidemie kampylobakteriózy způsobené konzumací syrového mléka nebo vody.7
Naše zjištění i výsledky jiných autorů potvrzují domněnku, že drůbež je významným zdrojem Campylobacter sp. pro člověka. Současně ne všechny kmeny jsou zřejmě stejně patogenní pro člověka. Na druhé straně je celá řada i jiných zdrojů, které mohou být zdrojem kampylobakteriózy pro člověka. Typizace izolátů Campylobacter sp. z různých zdrojů je předpokladem pro zjištění stavu a odhad míry rizika (risk assessment) různých zdrojů Campylobacter sp. pro člověka. Srovnání typů Campylobacter sp. izolovaných ze zvířat, prostředí, potravin a člověka pomůže odhalit rizikové potraviny a suroviny a vysvětlit způsob přenosu Campylobacter sp. na člověka.
Práce vznikla za podpory projektu COST OC NA.002.
Literatura:
1. Fermér C. H., Engvall E. O. Specific PCR identification and differentiation of the thermophilic campylobacters, Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, and C. upsaliensis. Journal of Clinical Microbiology 1999;37:3370-3373.
2. Nishimura M., Nukina M., Yuan J. M., Shen B. Q., Ma, J. J., Otha M., Saida T., Uchiyama T. PCR-based restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis and serotyping of Campylobacter jejuni isolates from diarrheic patients in China and Japan. FEMS Microbiology Letters 1996;142:133-138.
3. Korolik V., Alderton M. R., Smith S. C., Chang J., Coloe P. J. Isolation and molecular analysis of colonising and non-colonising strains of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli following experimental infection of young chickens. Veterinary Microbiology 1998;60:239-249.
4. Koenraad P. M. F., Ayling R., Hazeleger W. C., Rombouts F. M., Newell D. G. The speciation and subtyping of campylobacter isolates from sewage plants and waste water from a connected poultry abattoir using molecular techniques. Epidemiology and Infection 1995;115:485-494.
5. Studer E., Domke M., Wegműller L. J., Schmid S., Candrian U. RFLP and sequence analysis of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli PCR products amplified directly from environmental samples. Lebensmittel, Wissenschaft und Technologie 1998;31:537-545.
6. Nielsen E. M., Engberg J., Fussing V., Petersen L., Brogren C. H., On S. W. Evaluation of phenotypic and genotypic methods for subtyping Campylobacter jejuni isolates from humans, poultry, and cattle. Journal of Clinical Microbiology 2000;38:3800-3810.
7. Friedman C. R., Neimann J., Wegener H. C., Tauxe R. V. Epidemiology of Campylobacter jejuni infections in the United States and other industrialized nations. In: Nachamkin I., Blaser M. J. (Eds.), Campylobacter. Washington; ASM Press, Washington DC, 2000:121-138.
Adresa autora:
Doc. MVDr. Iva Steinhauserová, CSc.
Ústav hygieny a technologie masa FVHE VFU Brno
Palackého 1 - 3
612 42 Brno
E-mail: steinhauserovai@vfu.cz
