B. TREMLOVÁ,1 P. ŠTARHA2
1Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
2Vysoké učení technické Brno
Veterinářství 2004;54:652-655
SOUHRN
Tremlová B, Štarha P. Kvantitativní histologické stanovení kostní tkáně v masných výrobcích pomocí analýzy obrazu. Veterinářství 2004;54:652-655.
Cílem práce bylo připravit postup pro kvantitativní hodnocení masných výrobků pomocí histologického vyšetření. Byly detekovány kostní úlomky ve výrobcích z drůbežího masa. Postup zahrnoval přípravu preparátů, barvení alizarinovou červení, získání digitálních snímků a zpracování obrazovou analýzou (ACC, verze 4,0). Objekty byly identifikovány podle jejich barvy a jasu. Ve vzorcích byly zjištěny kostní úlomky v množství od 135 do 2167. Velikost úlomků se pohybovala od 5 do 2088 m, většina z nich nepřesáhla 500 m. Obsah kostní tkáně byl vypočítán jako poměr plochy kostní tkáně a plochy řezu. Korelační koeficient mezi histologickým vyšetřením a chemicky zjištěným obsahem vápníku byl 0,41 (metoda A), resp. 0,78 (metoda B).
SUMMARY
Tremlová B, Štarha P. Quantitative histological evaluation of the bone tissue in meat products by micrograph analysis. Veterinářství 2004;54:652-655.
The aim of this study was to establish the procedure for quantitative evaluation of bone tissue in meat products on the base of histological examination. For this reason, bone fragments in poultry meat products have been detected. This technique included preparation of the mounts (staining with alizarin red), taking the digital photography, processing and analysis of the micrographs (ACC, version 4.0). The objects were identified according to their colour and brightness. Number of bone particles in the samples varied from 135 to 2167. Bone particle dimension (length) ranged between 5 and 2088 m, but most fragments did not exceed 500 m. Bone tissue amount was counted in percentages as a ratio of the identified area of bone tissue to whole area of the section. Correlation coefficient between histometrical (bone content) and chemical (Ca2+) results was 0,41 (A assay) and 0,78 (B assay).
Kvantitativní vyšetření je založeno na zjištění počtu a velikosti analyzovaných součástí a hodnotí se pak ve vztahu k ploše vzorku. Není-li v zorném poli počítaných prvků mnoho, lze při manuálním měření zjistit jejich počet po celé jeho ploše snadno, při větším počtu objektů se však dopouštíme chyb. Přes řadu přesvědčivých publikovaných výsledků je širší použití takového hodnocení v praxi omezeno právě pro značnou náročnost manuálních měření a počítání. Postup je popsán např. v německé Úřední sbírce analytických metod,1 ale v praxi se nepoužívá. Možnost automatizovat a objektivizovat histometrické hodnocení nabízejí speciální počítačové programy pro analýzu obrazu.
Obrazová analýza pomáhá kvantitativně popsat a specifikovat obrazové informace, které byly získány makroskopickým či mikroskopickým snímáním, umožňuje detailní srovnávání různých vzorků, přesné zpracování informací a různé způsoby vyjádření získaných výsledků. Nespornou výhodou analyzátoru je automatické měření a počítání všech objektů, které jsme předem vybrali např. na základě parametrů pro barvu a jas. Měření různých parametrů pomocí obrazové analýzy je v případě vzorků potravin často ve vztahu k významným senzorickým a technologickým vlastnostem potravin a potravinových surovin. Například morfologie krystalů tuku hraje důležitou roli ve vlastnostech, jako je roztíratelnost, tvrdost a jemnost u finálních výrobků (margariny, máslo). Velikost a tvar krystalů byly měřeny pomocí semiautomatického procesu analýzy obrazu získaného elektronovou mikroskopií.2 Změny ve velikosti průměru vláken a délce sarkomer při zahřívání mohou vypovídat o změnách texturálních vlastností hovězího masa.3 Podobné parametry byly zjišťovány v souvislosti s hodnocením schopnosti masa vázat vodu při různých podmínkách pH.4 Při stanovení kostních úlomků v masných výrobcích bylo pomocí obrazové analýzy určováno množství a velikost částic a množství ve vztahu k použitému separátoru a výchozí surovině.5
Pro aplikaci obrazové analýzy jsme vybrali stanovení kostních úlomků ve výrobcích z drůbežího masa. Jejich výskyt souvisí s použitím konkrétní výrobní suroviny – separátu (podle současné legislativy strojně oddělené maso), jinak je jejich přítomnost jen náhodná a ojedinělá. Pro zvýraznění kostní tkáně lze využít cílené barvení. Práce zahrnuje stanovení velikostí a počtu objektů, využití získaných dat pro určení obsahu kostní tkáně v masném výrobku a porovnání histologicky zjištěných výsledků s výsledky získanými chemickou analýzou.
Materiál a metody
Vyšetřili jsme vzorky z 29 drůbežích výrobků různého druhu (párek, salám, klobása, sekaná). Z každého výrobku byly odebrány čtyři vzorky z různých míst a zpracovány na parafínové řezy. Preparáty byly barveny alizarinovou červení (cílené barvení pro kostní tkáň). Pro snímání a následnou analýzu byly vybrány čtyři řezy (z každého vzorku jeden) odpovídajícího barevného schématu.
Pro získání obrazů jsme nejdříve použili techniku postupného snímání řezu (postup A). Při nejmenším možném zvětšení (32x), které bylo možné použít, tvořilo obrazovou dokumentaci jednoho vzorku průměrně 36 snímků (podle velikosti řezů), každý snímek se zpracovával samostatně a výsledky se sumarizovaly. Takový postup byl velmi zdlouhavý, a proto jsme tuto fázi modifikovali (postup B) použitím skenovacího zařízení, které umožnilo sejmout celý řez najednou, tzn. pracovalo se čtyřmi obrazy pro každý vzorek. Modifikována byla i vlastní obrazová analýza. Porovnávali jsme potom výsledky obou postupů s údaji získanými chemickou analýzou.
Analýzu obrazu jsme provedli pomocí programu ACC (Image Structure and Objekt Analyser, v. 4.0, firma SOFO, CZ).
Postup A: Fotometrická kalibrace a transformace hodnot pixelů je nutná pro zajištění správné identifikace objektů, která je pak provedena automaticky podle předem nastavených parametrů (zadání hodnot pro barvu a jas objektu). Velmi malé objekty byly následně z měření vyloučeny. Vlastní analýza zahrnovala měření ploch vybraných objektů a měření plochy hmoty řezu bez prázdných míst uvnitř řezu.
Postup B: Odlišuje se v metodě pořízení digitálního obrazu preparátu, při které dochází k menší degradaci obrazu z důvodu jednoduššího optického systému a dále v principu identifikace objektů, který je založen jen na základě jasu černobílého obrazu. Nepracuje se zde stále s barevným obrazem (jako u postupu A), ale obrazy se převedou na černobílé, kde oblasti výskytu vápníku znázorňuje intenzita bílé barvy. Pro určení množství vápníku se zahrnuje i intenzita obarvení objektu. Metoda byla navržena pro zjištění obsahu vápníku, nikoliv pro kvantitativní hodnocení jednotlivých kostních úlomků.
Obsah kostní tkáně v % v hmotě řezu zjištěný metodou A a obsah vápníku v % v hmotě řezu zjištěný metodou B, byly porovnány s výsledky chemické analýzy vzorků prostřednictvím výpočtu korelačního koeficientu.
Chemické vyšetření vzorků bylo provedeno jako stanovení vápníku metodou atomové absorpční spektrometrie.
Výsledky a diskuse
Pro analýzu obrazu je nutné použít speciální barvicí postupy, které zřetelně barevně odliší kostní úlomky od ostatních součástí, protože jejich identifikace je založena na výběru objektů podle barvy a jasu. Tomuto požadavku zvolený postup barvení alizarinovou červení vyhovuje. Barvivo vytváří komplex s kalciovými ionty pomocí chelátové vazby. Kostní úlomky se barví jasně červeně, ostatní součásti různými odstíny modré až zelené barvy, některé součásti rostlinného původu se nebarví vůbec. Pro automatické zpracování snímků obrazovým analyzátorem je velmi důležité použít kvalitně obarvené preparáty, jakákoliv odchylka od standardního barevného schématu vede k nesprávným výsledkům. Pro identifikaci objektů jsme připravili šablonu - na vybraném standardně obarveném kostním úlomku stanovením požadavků pro tón a intenzitu zbarvení. Použitím šablony se pak automaticky označily objekty se zadanými parametry v celém obraze.
Pomocí programu pro analýzu obrazu jsme postupem A v jednotlivých vzorcích masných výrobků identifikovali kostní částice v počtu 135 až 2167. Množství kostních částic závisí na podílu separovaného masa ve výrobku. Vysoké počty velmi malých částic mohou být také zjišťovány u vzorků, které jevily odchylku od standardního barevného obrazu. V těchto případech je možný manuální výběr objektů. Znamená to však změnu podmínek, které by měly být pro všechna měření stejné.
Při orientačním vyšetření postačuje k vyjádření výsledku počet částic nebo průměrný počet úlomků na jeden řez (v případě, že není vyšetřován stejný počet řezů u každého vzorku). Plocha řezů však není vždy stejná, a proto přesnější postup vyžaduje její změření a vyjádření výsledků jako počtu objektů na mm2 plochy řezu, resp. hmoty vzorku. Všechny tyto výsledky pak mají vypovídací hodnotu jen v případě porovnání se standardním vzorkem. Protože nemáme k dispozici standardní vzorek, vybrali jsme ze souboru a porovnali mezi sebou výrobky stejného názvu, u kterých lze očekávat stejné složení.
Variabilita výsledků při porovnání výrobků stejného názvu může souviset s výchozími vlastnostmi výrobní suroviny, spíše je však důsledkem nedodržení výrobního postupu (podílu strojně odděleného masa). Pro posouzení významnosti rozdílů a určení přijatelného rozmezí výsledků však není zatím k dispozici dostatek údajů.
Velikost objektů (délka) se pohybovala od 5 do 2088 mikrom. Podobně jako jiní autoři5 jsme zjistili, že naprostá většina objektů je do velikosti 1000 mikrom., v našem případě dokonce do 500 mikrom. Velikost kostních částic závisí na surovině použité pro výrobu strojně odděleného masa, dále na typu separačního zařízení, ale především na jeho seřízení a správné funkci. Technická norma6 uvádí, že 90 % všech částic musí být menší než 1 mm a žádná nesmí přesahovat 2 mm, v tomto ohledu nevyhověly dva vzorky. Pro potřeby praxe by postačovalo rychlé orientační vyšetření, zde by bylo možné použít šablonu – síť s velikostí polí 1 x 1 mm.
Je obvyklé určovat obsah kostní tkáně a tím i použití separovaného masa na základě chemického stanovení vápníku. Obsah vápníku souvisí rovněž se způsobem získání separovaného masa a charakteru zpracovávané suroviny. Ve vyšetřených výrobcích se pohybovaly hodnoty obsahu vápníku stanovené metodou atomové absorpční spektrometrie od 0,025 % až po 0,108 %. Postupem B byl určen obsah vápníku v hodnotách od 0,014 % do 0,142 %. Pro masné výrobky nejsou zatím požadavky v našich předpisech stanoveny. Norma6 uvádí požadavek na maximální obsah vápníku v separovaném (strojně odděleném mase) v hodnotě 0,3 %, to je vyšší hodnota v porovnání s údaji z literatury.7 V rakouských předpisech8 najdeme hraniční hodnotu pro vyslovení podezření na zpracování separovaného masa do výrobků 200 mg.kg-1 vápníku, tzn. 0,02 %.
Modifikace postupu snížila několikanásobně pracnost celého stanovení, ale ukázala se být rovněž pozitivním faktorem pro zvýšení korelace mezi histologickým a chemickým vyšetřením. Korelační koeficient mezi výsledky zjištěnými metodou A a výsledky chemického vyšetření byl 0,41. Při hodnotě korelačního koeficientu 0,78 (postup B) u 24 vyšetřených vzorků a hladině významnosti alfa = 0,05 již lze hovořit o statisticky významné závislosti.
Závěr
Vyšetřili jsme drůbeží masné výrobky pomocí obrazové analýzy s cílem určit počet a velikosti kostních úlomků a zjištěné výsledky použít pro hodnocení výrobků. Při porovnání výrobků stejného názvu byly zjištěny rozdíly v množství kostních úlomků, které mohou být důsledkem nedodržení výrobního postupu. Vytvořili jsme dále postup pro histologické stanovení obsahu kostní tkáně v masných výrobcích pomocí obrazové analýzy. Výsledky jsme ověřili porovnáním s chemickým vyšetřením vápníku atomovou absorpční spektrometrií. Korelace obou metod je vyjádřena koeficientem 0,78. Použití obrazové analýzy znamená v případě histometrických vyšetření masných výrobků značné urychlení práce. Objektivní výsledky však můžeme získat jen za podmínky kvalitního a standardního zpracování preparátů. Objektivnost výsledku je také možné ovlivnit vyšším počtem vyšetřených řezů a prací s obrazem celého řezu.
Pro kontrolu naplnění požadavků norem pro strojně oddělené maso (určení velikosti a tvaru kostních úlomků) lze získat s použitím analýzy obrazu přesné výsledky. Pro orientační vyšetření lze připravit jednoduchou šablonu. Využití histometrických vyšetření u masných výrobků nemá zatím z hlediska praxe žádný legislativní podklad.
Podpořeno projektem Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy č. 162700005
a projektem CEZ: J 22/98 : 261100009 (Netradiční metody studia komplexních a neurčitých systémů).
Literatura:
1. Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG, Bestimmung der geweblichen Zusammensetzung von Fleisch, Fleischerzeugnissen und Wurstwaren L 06.00.13, Beuth Verlag Berlin und Köln, 1989.
2. Heertje I, Leunis M. Measurement of shape and size crystals by electron microscopy. Food Sci Technol-Leb 1997;30:141-146.
3. Palka K., Daun H. Changes in texture, cooking losses and myofibrilar structure of bovine M. semitendinosus during heating. Meat Sci 1999;51:237 – 243.
4. Rao M. V., Gault N. F. S., Kennedy S. Variations in water-holding capacity due to changes in fibre diameter, sarcomere lenght and connective tissue morphology of some beef muscles under acidic conditions below the ultimate pH. Meat Sci 1989;26:19 – 37.
5. Hildebrandt G., Hirst L. Determination of the collagen, elastin and bone content in meat products using television image analyse. J. Food Sci 1985;50:568 – 570.
6. Podniková norma PN 27/2000: Mechanicky separované drůbeží maso, polotovary z drůbeže. XAVEROV holding, a. s., Praha, 2000.
7. Koolmees P. A., Bijker P. G., van Logestijn J. G., Tuinistra-Melgers J. Histometrical and chemical analysis of mechanically deboned pork, poultry and veal. J Anim Sci 1983;63:1830 – 1837.
8. Österreichisches Lebensmittelbuch – Codex Alimentarius Austriaticus, Teilkapitel D 4, Verlag Brüder Hollinek, Wien, 1993.
Adresa autora:
Doc. MVDr. Bohuslava Tremlová, PhD.
Ústav hygieny a technologie masa Veterinární a hygienické fakulty VFU Brno
Palackého 1 – 3
612 42 Brno
