D. HANZLÍČEK
Klinika JAGGY, Brno
Veterinářství 2009;59:529-532.
SOUHRN
Hanzlíček D.: Odběr a vyšetření aspirátu kostní dřeně – jsme připraveni?
Vyšetření aspirátu kostní dřeně je důležitou a nezastupitelnou intravitální diagnostickou metodou nejen v hematologii. V příspěvku jsou stručně popsány indikace vyšetření kostní dřeně, dále postup biopsie, možné komplikace a nezdary při odběru a zpracování vzorku. Absolutní kontraindikace nejsou žádné. Cílem příspěvku je otevřít toto téma pro veterinární obci na stránkách odborného časopisu a také ukázat, že odběr aspirátu kostní dřeně je poměrně snadnou procedurou což by mohlo případně podnítit veterináře k provádění těchto biopsií.
SUMMARY
Hanzlíček D.: Collection and examination of bone marrow aspirate – are we ready?
Examination of bone marrow aspirate is important and unsubstitutable intravital diagnostic method not only in hematology. This contribution shortly describes indication for bone marrow examination, biopsy practice, possible complication and failures at collection and processing of sample. There are no absolute contraindications. The aim of this work is to open this theme for veterinary staff on the pages of professional journal and also present that sampling of a bone marrow aspirate is relatively easy procedure, which could vets eventually inspire for performing these biopsies.
Úvod
S razantním pokrokem veterinární medicíny a vzrůstající ochotou majitelů investovat do diagnostiky a terapie svých domácích zvířat (považovaných ne neprávem za členy rodiny) i v našich podmínkách se stalo nevyhnutelností používání diagnostických metod a vyšetření, které ještě před několika lety byly považovány za nereálné a vyvolávaly v lepším případě ironické úsměvy či poklepávání na čele. Mezi nejmarkantnější případy patří v oblasti zobrazovacích metod magnetická rezonance (MRI) nebo artroskopické a laparoskopické diagnosticko-terapeutické zákroky. Na poli interní hematologie je takovýmto jevem bezesporu cytologické vyšetření kostní dřeně. I když je toto vyšetření známé a doporučované již minimálně desetiletí,1,2 není v našich českých (a slovenských) reáliích podle autorových zkušeností téměř vůbec prováděné. Jedním z logických a pochopitelných důvodů je poměrně vysoký nárok na cytologické znalosti a zkušenosti posuzovatele aspirátu kostní dřeně a s tím spojenou (a ještě možná náročnější) interpretaci. Pro interpretaci a klinické uplatnění nálezů vyšetření kostní dřeně je esenciální znalost klinické medicíny, což je jeden z mnoha důvodů, proč je naprosto nevhodné využívat služeb humánního specialisty bez teoretických a praktických zkušeností z veterinární hematologie.
Naopak neopodstatněná je obava z odběru vzorku a přehánění možných rizik a kontraindikací aspirace kostní dřeně. Autorovy vlastní zkušenosti i zkušenosti zahraničních renomovaných pracovišť jsou jednoznačné – odběr vzorku je technicky velmi nenáročný a rizika a nepříznivé efekty a následky nejsou téměř žádné.
Histologické vyšetření kostní dřeně (core biopsy) je ve srovnání s cytologickým vyšetřením technicky i časově náročnější, dražší a neumožňuje takové detailní posouzení buněčné morfologie jako cytologické vyšetření. Navíc je nutné na něj pacienty přinejmenším sedovat.2
Cílem tohoto příspěvku je seznámit čtenáře s indikacemi a kontraindikacemi odběru kostní dřeně, s technikou odběru vzorků a v neposlední řadě pokusit se rozptýlit případné obavy z odběru kostní dřeně.
Klinické indikace
1. hematologické
a. neregenerativní nebo špatně regenerativní anemie (nevysvětlitelná jinými vyšetřeními)
b. trombocytopenie, i závažná, která je spojená s klinickými projevy – krvácivostí (zejména ty závažné jsou indikací k vyšetření kostní dřeně!)
c. perzistentní neutropenie
d. pancytopenie
e. polycytemie – bez známek dehydratace či hemokoncentrace, u jiných než chrtovitých plemen
f. nevysvětlitelná výrazná trombocytóza
g. nevysvětlitelná perzistující leukocytóza, zejména lymfocytóza a neutrofilie
h. nález morfologicky abnormálních buněk v krevním nátěru (například nález většího množství jaderných erytroidních buněk bez současně se vyskytující anemie)
2. jiné než hematologické
a. součást diagnostiky syndromu horečky neznámého původu
b. diagnostika, případně monitoring terapie leishmaniózy
c. nevysvětlitelná hyperkalcemie a/nebo hyperglobulinemie (podezření na multipní myelom nebo lymfom/leukémii)
3. součást stagingu nádorů, zejména lymfomu a mastocytomu1,2
Kontraindikace
nespolupracující/agresivní pes nebo kočka bez možnosti sedace, jinak žádné (!)
Technika odběru
1. volba místa odběru: v literatuře je popsáno mnoho míst použitelných k biopsii.1 Autor využívá jako první volby proximální hlavici humeru, v místě tuberculum majus (obr. 1) a jako alternativu dorsální okraj hřebenu kosti kyčelní (obr. 2a, 2b). Důvodem této preference je fakt, že jsou obě tyto lokality snadno identifikovatelné na těle psů (i pro internisty) a velmi dobře dostupné a to i u obézních pacientů.
2. příprava pacienta: po standardní přípravě sterilního pole doporučuji lokální anestézii – aplikace 0,5 – 1 ml lokálního anestetika (autor používá 2% lidokain) na periost v místě průniku odběrové jehly do kosti.
3. výběr bioptické jehly: podmínkou je dostatečná tloušťka jehly (16 – 18 G) a vyjímatelný a znovu zasunovatelný mandrén (stylet) (obr. 3).
4. technika odběru: jehla se vpichuje do kostní dřeně vždy s mandrénem, v místě vpichu je možno udělat kožní incizi (není podmínkou). Jehlu je nutno držet tak, aby byla opřena opačným koncem (konusem s hlavicí mandrénu) o dlaň, a mezi prsty je sevřena jehla. Po iniciálním vpichu je jehla zaváděna krouživými pohyby střádavě ve směru a proti směru hodinových ručiček až do momentu, kdy se zdá být v kostní dřeni (pod kompaktou kosti). Jednoduchým testem je cvrnknutí prstem do konusu jehly a pokud vibruje, je pevně ukotvená v kosti a šance na úspěšný odběr vzorku je vysoká. Po vytažení mandrénu asistentem je na konus jehly nasazena stříkačka (10 nebo 20 ml) a vyvinut pístem co největší podtlak. Při úspěšném odběru se objeví v konusu jehly a ve stříkačce malý objem krvavé tekutiny, pokud tomu tak je, je povolen podtlak a píst pomalu vrácen do původní pozice. Jehla i se stříkačkou je vytažena z kosti a vzorek je pomocí tlaku vzduchu stříkačky přenesen na připravená podložní sklíčka postavená v úhlu zhruba 60° k podložce. Pokud se při vytváření podtlaku neobjeví v konusu vzorek, je nutno vrátit mandrén zpět do jehly, a pokračuje se v zavádění jak je výše popsáno. Po vytažení jehly je nutno na místo vpichu přiložit gázu napuštěnou dezinfekcí a komprimovat manuálně (silným tlakem) alespoň 5 minut.
Vytvoření preparátu metodou roztěru
vzorek kostní dřeně se nechá stéct po sklíčku a ihned (do 10 sekund) se roztírá druhým sklíčkem čímž se vytvoří dva preparáty (obr. 4). Kostní dřeň za několik sekund aglutinuje, proto je nutné pracovat velmi rychle. Doporučuji provádět roztěry ve dvou osobách, aby bylo vytvořeno co nejvíce kvalitních vzorků. Proti srážení je možno stříkačku „protáhnout“ pár kapkami 5% roztoku EDTA. Heparin je pro tento účel nevhodný, protože mění morfologii buněk (prof. Moritz A., osobní sdělení, 2006).
Fixace a obarvení vzorků
prvním krokem je důkladné zaschnutí sklíček. Pokud jsou sklíčka se vzorky dobře zaschnutá a skladována v suchu, lze je skladovat i několik dnů bez ztráty kvality preparátu. Barvit je možno různými typy barvení. Velmi dobrý detail cytoplazmy a hlavně jader poskytuje zejména barvení May-Grünwald Giemsa. Detailní obarvení vzorků kostní dřeně vyžaduje často delší lázeň v barvících roztocích ve srovnání s méně buněčnými vzorky jako např. krevní nátěr.2 Pokud jsou vzorky odesílány na posouzení, je vhodné poslat vždy více, zejména neobarvených vzorků.
Nejčastější chyby a obtíže při odběru, zpracování a barvení aspirátu kostní dřeně
1. nátěr neobsahuje zrnka ani buňky kostní dřeně, pouze krev.
a. Vzorek nebyl odebrán z kostní dřeně, ale z kompakty, nebo cévy v podkoží.
b. Při aspiraci stříkačkou nebyl vyvinut dostatečný podtlak a došlo jen k nasátí krve.
c. Na aspiraci byla použita stříkačka menší než 10 ml.
d. Jedná se o hypocelulární kostní dřeň, tedy v dané lokalitě je již funkční tkáň kostní dřeně plně nahrazena tukovou tkání. Dochází k tomu zejména u starších pacientů nebo onemocnění způsobující hypoplazii kostní dřeně.1,2 Odběr kostní dřeně je nutno opakovat z jiného místa, nejlépe z dorzálního okraje kosti kyčelní, kde zůstává aktivní kostní dřeň do vysokého věku.
2. po počátečním silném odporu při zavádění jehly – při odběru z proximální hlavice humeru – došlo náhle k uvolnění odporu, při aspiraci je natažena do stříkačky průhledná, žlutavá nebo krvavá, silně viskózní tekutina.
a. došlo k punkci ramenního kloubu. Zachovat klid, jehlu krouživým pohybem vytáhnout. Na pacientovi se tato drobná nehoda většinou klinicky neprojeví.
3. buňky jsou destruované, ve formě tzv. volných jader nebo vláken chromatinu
a. nešetrným zpracováním (přílišné tlačení na sklíčka při roztěru) došlo k destrukci buněk.
b. pacient trpí leukemií/lymfomem metastazujícím do kostní dřeně a všechny buňky jsou pravděpodobně lymfoblasty, které jsou velmi fragilní a může dojít k jejich destrukci i při relativně šetrném zpracování vzorku.
c. pacient trpí onemocněním způsobující nekrózu kostní dřeně.
d. pacient je mrtvý (postmortální nekróza nastupuje velmi rychle a tudíž i posuzování a interpretace vzorků kostní dřeně odebraných při pitvě je velmi obtížné).
4. jaderné buňky jsou soustředěné do shluků (neleží v jedné rovině), často se ve shlucích nachází sít amorfní hmoty a/nebo s agregáty trombocytů
a. došlo ke koagulaci vzorku. Jedná se o velmi častý problém zejména u začátečníků. Proto doporučuji zejména ze začátku do jehly a stříkačky natáhnout kapku roztoku EDTA.
5. buňky jsou místy velmi málo obarvené, zejména uprostřed preparátu, nebo jsou místy příliš eozinofilní nebo příliš bazofilní. Na okraji vzorku jsou buňky často přebarvené:
a. nestejné obarvení je poměrně časté u nerovnoměrně silné vrstvy preparátu. Doporučuji neprodlužovat dobu barvení, ale během barvení třepat nebo štěrchat s nádobkou se vzorky
6. buňky jsou málo obarvené v téměř celém preparátu
a. krátká doba barvení. Často je nutno až zdvojnásobit dobu barvení oproti krevnímu nátěru
b. staré nebo vyčerpané barvení. Výměna (nikoliv dolévání!) barev by měla být prováděna min. 2x měsíčně i při minimálním počtu barvených preparátů. V laboratořích, kde se vyšetřuje více než 20 vzorků denně by se měly barvící roztoky vyměňovat za nové denně.
Komplikace a vedlejší efekty aspirace kostní dřeně
Odběr aspirátu kostní dřeně, pokud je proveden správně na správném místě, nepřináší v podstatě žádné komplikace.1 Autor se nikdy nesetkal s iatrogenní infekcí po punkci. Taktéž často obávané krvácení po aspiraci kostní dřeně u pacientů s koagulopatií (včetně pacientů s téměř absencí trombocytů) autor nikdy nepozoroval.
Orientační, systematický přístup k posuzování aspirátu kostní dřeně
Posouzení aspirátu kostní dřeně vyžaduje poměrně značné teoretické znalosti morfologie prekurzorů krevních buněk a ještě větší praktické zkušenosti. Podle mínění autora není možné se naučit posuzovat vzorky kostní dřeně pouze z knih. Na základě osobních zkušeností doporučuji posuzovat prvních několik desítek preparátů vždy se zkušeným cytologem. Níže je uveden pouze zevrubný návod postupu vyšetření vzorku (detailnější popis přesahuje rozsah tohoto příspěvku).
1. Ještě před posuzováním jaderných buněk se zhodnotí obecná kvalita preparátu, míra obarvení a míra kontaminace krví.
2. Celularita preparátu – určuje se podle proporcionálního zastoupení tukových vakuol v poměru k jaderným buňkám v zrnkách kostní dřeně. Zrnka jsou velké (na sklíčku prostým okem viditelné) shluky prekursorových buněk a buněk stromatu kostní dřeně.
3. Množství megakaryocytů – určuje se pod malým zvěšením (100x) nejlépe v celém jednom preparátu.
4. posouzení erytroidní řady – morfologie erytroidních prekurzorů, a přítomnost případných aberantních buněk (dyserytropoeza). Dále se posuzuje maturace – dozrávání erytroidních buněk. Počty mladých a zralejších prekurzorů erytrocytů by měly být v určitém poměru: nejvíce (asi 80 %) jsou zastoupeny pozdější stadia erytropoezy (rubricyty a metarubrycyty,). Rubriblastů (nejmladší prekurzory) je nejméně.2
5. posouzení myeloidní řady – morfologie a posouzení maturace – poměr mladých a zralejších (analogicky jako u erytroidní řady).
6. Stanovení M/E poměru (= poměr všech myeloidních ku všem prekurzorům erytroidní řady). Norma se pohybuje mezi 0,75/1 až k 2/1.1,2
7. Přítomnost dalších buněk – lymfocytů a lymfoblastů (obr. 5), plazmocytů, makrofágů, histiocytů, mastocytů a nádorových buněk (metastazujících). Dále při podezření se hledají parazité, zejména leishmanie.
8. stanovení cytologické diagnózy
9. klinická interpretace nálezů – případně doporučení další diagnostiky či terapie.
obr. 5
Závěr
V indikovaných případech je vyšetření kostní dřeně velmi přínosné a mnohdy nezastupitelné v diagnostice chorob malých zvířat. Technická nenáročnost a provádění u psů pouze v lokální anestézii z něj činí nástroj použitelný i v běžné klinické praxi. Vlastní vyšetření a interpretace (které nejsou součástí příspěvku) by ovšem měly být prováděny pouze zkušeným veterinárním klinickým patologem (cytologem).
Literatura:
1. Cowell, R. L., Tyler, R. D., Meinkoth, J. H. Bone Marrow. In: Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat. Mosby 2nd ed., 1999;284-304.
2. Harvey, J. W. Bone Marrow Examination. In: Atlas of Veterinary Hematology. WB Saunders 1st ed., 2001;93-125.
Adresa autora:
MVDr. David Hanzlíček
Klinika JAGGY
Komárovská 5
617 00 Brno
hanzlicek@jaggy.cz
