Problematika reziduí inhibičních látek v syrovém kravském mléce

P. NAVRÁTILOVÁ
Ústav hygieny a technologie mléka Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
Veterinářství 2002;52:478-481

SOUHRN
Navrátilová P. Problematika reziduí inhibičních látek v syrovém kravském mléce. Veterinářství 2002;52:478-481.
Výskyt reziduí inhibičních látek (RIL) v surovinách a potravinách živočišného původu představuje zdravotní riziko pro spotřebitele, přináší technologické problémy ve výrobě potravin a má negativní dopad na životní prostředí. Nálezy RIL v mléce souvisí s rozšířeným používáním veterinárních léčiv, s nedodržováním ochranných lhůt, se změnou metabolismu nemocného zvířete, popř. s nedůsledným vylučováním mléka léčených zvířat z dodávky. Jedním z problémů v humánní a veterinární medicíně je rostoucí rezistence patogenních mikroorganismů k antimikrobiálním látkám. Vzrůstající počet rezistentních kmenů bakterií je způsoben neuváženým podáváním antibiotik k léčbě infekcí v humánní i ve veterinární medicíně. Více než polovina celkové spotřeby antibiotik nachází využití právě v zemědělství. Důležitým krokem k prevenci přítomnosti antimikrobiálních látek v mléce jsou důsledná opatření v prvovýrobě mléka a využívání screeningových metod detekce RIL.

SUMMARY
Navrátilová P. Inhibitory substances residua (ISR) in raw milk of the cow. Veterinářství 2002;52:478-481.
Occurrence of the inhibitory substances residua (ISR) in animal products represents health risk for consumers, brings technological difficulties in food production and has a negative impact on the environment. The findings of ISR in milk are connected with the widespread use of veterinary remedies, with non-observance of the recommended label withdrawal time, with the change of the sick animal metabolism or with the inconsistency in elimination from milk of animals after administration. Acquired resistance of the pathogenic microorganisms to the antimicrobial substances is one of the problems in both human and veterinary medicine. Using inappropriate antibiotics for treatment humans as well as animals causes increasing number of resistant bacteria strains. More than half of the whole use of antibiotics we can find in the agriculture. Consistent monitoring in the place of original production and making full use on-farm residue screening tests are, as we believe, an important step to the prevention of antibiotic residues in milk.

Zdravotní nezávadnost, jakost a nutriční hodnota mléčných výrobků je podmíněna nákupem hygienicky nezávadné suroviny. Jakost syrového kravského mléka charakterizuje soubor ukazatelů, z nichž nejvýznamnější je hygienická a senzorická jakost, obsah základních složek a výskyt nežádoucích, tj. cizorodých a inhibičních látek. Jedním z hlavních kritérií hygienické jakosti syrového mléka je absence reziduí látek, které se do mléka dostávají v důsledku prevence a tlumení mastitid, a minimální kontaminace mléka látkami z vnějšího prostředí.¹
Při tvorbě mléka, během dojení, při ošetřování mléka po nadojení, ale i při jeho dalším zpracování včetně balení mohou do mléka přecházet nežádoucí, tzv. cizorodé látky. Tyto látky nejsou přirozenou součástí potravin a jejich přítomnost v nich nebo obsažené množství může mít vliv na zdraví člověka. Do skupiny cizorodých látek zařazujeme látky přídatné (aditivní), znečišťující (kontaminující) a rezidua cizorodých látek úmyslně použitých v zemědělské a potravinářské výrobě.² Závažným problémem je výskyt inhibičních látek, jejichž přítomnost v syrovém kravském mléce zvyšuje zdravotní rizika u spotřebitele, může mít negativní dopad na životní prostředí a rovněž přináší technologické problémy při zpracování mléka.

Inhibiční látky
Pod pojmem inhibiční látky rozumíme látky, které svými baktericidními, případně bakteriostatickými účinky znesnadňují nebo úplně znemožňují zpracování mléka na mléčné výrobky, při jejichž výrobě se používají čisté mlékařské kultury (ČMK), např. kysané mléčné výrobky, sýry a tvarohy.³ Obecně tak můžeme označit látky, které mají tlumivý vliv na rozvoj a aktivitu mlékařských kultur a zákysů. V případě, že se nachází v mléce ve vyšších než minimálních inhibičních koncentracích (vzhledem k použitým ČMK), projeví se jejich inhibiční účinek během technologického zpracování mléka. Jestliže se v mléce nacházejí v subinhibičních koncentracích, pak jejich přítomnost má hygienický význam jako chemický kontaminant. K průniku inhibičních látek do mléka může docházet intravitálně nebo posekretoricky.²
Mléku mohou propůjčit inhibiční účinnost:^2,4,5
- terapeutické aplikace antibiotik, sulfonamidů a jiných biologicky aktivních látek
- medikované krmné směsi s obsahem antibiotik a některé neantibiotické stimulátory z krmných směsí určených pro jiná zvířata zkrmené dojnicím
- zbytky čisticích a desinfekčních látek
- silně zaplísněná krmiva (mykotoxiny)
- některé látky rostlinného původu, např. fytoncidy (hořčice)
- konzervační a neutralizační látky
- pesticidy, insekticidy, případně další látky (těžké kovy)
Mléka, která působí inhibičně z dalších příčin:
- zvláštní skupinu tvoří inhibiční látky vyskytující se jako přirozený ochranný systém mléčné žlázy, tj. imunoglobuliny, lysozym, laktoferin, případně další bakteriostaticky působící látky. Většina těchto látek pasterací mléka ztrácí inhibiční účinnost. Zvýšené koncentrace přirozených inhibičních látek jsou zjišťovány v mastitidním mléce, mlezivu nebo mléce starodojném
- sníženou kysací schopnost vykazují mléka od dojnic s dietetickými a metabolickými poruchami.
Nejvýznamnějšími inhibičními látkami jsou ty, které i v malých koncentracích mají značný inhibiční účinek – antibiotika, sulfonamidy a další biologicky aktivní látky. Nálezy RIL v mléce souvisí zejména s rozšířeným používáním veterinárních léčiv, často nekontrolovaným, s nedodržováním ochranných lhůt, se změnou metabolismu nemocného zvířete, případně s nedůsledným vylučováním mléka léčených zvířat z dodávky.⁴

Rizika spojená s výskytem reziduí antibiotik a sulfonamidů v mléce
Přítomnost reziduí antibiotik nebo dalších chemoterapeutik v mléce znamená riziko pro spotřebitele. Výše rizika závisí na druhu antibiotik, na jejich biologických zvláštnostech i na jejich koncentraci v mléce. K nejčastěji uváděným rizikům patří alergické reakce, možnost vzniku rezistence na antibiotika a nepříznivý vliv na přirozenou mikroflóru lidského organismu. Alergické projevy mohou mít nejrůznější stupnici intenzity a projevů - od svědění a kopřivky přes otoky až k anafylaktickému šoku. Nebezpečná je zejména přítomnost penicilinu, na který má poměrně mnoho lidí zvýšenou citlivost. Stopové dávky antibiotik mohou stimulovat vznik rezistentních kmenů mikroorganismů. Dalším rizikem je možnost nepříznivé modifikace přirozené mikroflóry ve střevním traktu člověka.⁶

Legislativa
Směrnice 92/46/EHS Rady vymezila základní jakostní znaky syrového kravského mléka.⁷ Mléko musí splňovat podmínky uvedené:
- v příloze A, kapitola I. - mléko musí pocházet od krav, které nebyly ošetřeny látkami, které jsou nebo by se mohly stát nebezpečnými pro zdraví člověka a které se mohou přenášet mlékem;
- v příloze A, kapitola III. - k lidské spotřebě nemůže být určeno mléko, jehož obsah reziduí farmakologicky aktivních látek přesahuje povolené hladiny pro jednu z látek popsaných v přílohách I a III Nařízení EHS č. 2377/90 (modifikováno nařízením č. 675/92).
V ČR byly požadavky na syrové kravské mléko plně harmonizovány s uvedenými předpisy EU. Jakost syrového kravského mléka k mlékárenskému ošetření a zpracování a mléka určeného k přímé spotřebě je sledována v souladu s vyhláškou MZe č. 287/1999 Sb., o veterinárních požadavcích na živočišné produkty.⁸ Podle § 42 této vyhlášky musí být z dodávky mléka k mlékárenskému ošetření a zpracování vyloučeno mléko s obsahem reziduí inhibičních, pesticidních a kontaminujících látek. Kritéria hodnocení jakosti mléka jsou obsažena i v nezávazné ČSN 57 05 29 Syrové kravské mléko.⁹
V surovinách a potravinách živočišného původu smí být přítomny jen hodnoty maximálních reziduálních limitů (MLR) původní substance nebo metabolitu veterinárních léčiv. MLR se rozumí maximální množství (vyjádřeno v mg/kg suroviny) zbytků veterinárních léčiv a biologicky aktivních látek použitých v živočišné výrobě, které je přípustné v surovině živočišného původu nebo na ní. Při překročení nejvyššího přípustného množství reziduí veterinárních léčiv a biologicky aktivních látek používaných v živočišné výrobě se potravina nebo potravinová surovina nepovažuje za zdravotně nezávadnou (§ 2 zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, § 2 vyhlášky MZ č. 273/2000 Sb.).^10,11 S ohledem na charakter stanoveného maximálního limitu reziduí se veterinární léčiva zařazují do 4 skupin (vyhlášky MZ č. 273/2000 Sb. a č. 106/2002 Sb.):
- skupina I, kde jsou MLR stanoveny,
- skupina II, kde nejsou s ohledem na zjištěnou neškodnost pro lidské zdraví maximální limity reziduí stanoveny,
- skupina III, kde mají MLR v EU pouze dočasnou platnost,
- ve IV. skupině jsou uvedena léčiva nebezpečná pro zdraví člověka, která nesmějí být používána pro zvířata určená k výrobě potravin: ronidazol, nitrofurany, metronidazol, kolchicin, chlorpromazin, chloroform, chloramfenikol, dimetridazol, dapson, Aristolochia ssp. a preparáty z ní.^11,12
Podle zákona MZe č. 166/1999 Sb., o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů, který stanoví základní veterinární požadavky na živočišné produkty mohou být zvířata, jimž byly podány doplňkové látky a léčiva zanechávající nežádoucí rezidua v živočišných produktech, využívána k získávání a výrobě produktů určených k výživě lidí až po uplynutí ochranné lhůty. Nebyla-li tato lhůta výrobcem stanovena, mohou být zvířata takto využívána až po uplynutí nejméně 60 dnů od skončení podávání doplňkových látek nebo léčiv, jde-li o maso, vnitřnosti a tuky, a nejméně 21 dnů od skončení podávání doplňkových látek a léčiv, jde-li o mléko a vejce.¹³

Kontrola reziduí antibiotik a sulfonamidů v mléce
Předpisy EU stanovují v mléce MLR u řady substancí. V současnosti však neexistuje metoda umožňující detekovat všechny tyto substance ve stanovených hladinách. Proto byl IDF (International Dairy Federation) vyvinut tzv. integrovaný systém kontroly antibiotik v mléce, jehož cílem je zajištění kvalitní suroviny pro mlékárenské zpracování a zabezpečení zdravotní nezávadnosti mléka a mléčných výrobků pro spotřebitele. Integrovaný systém je bariérový systém využívající HACCP konceptu k minimalizaci rizika. Zahrnuje dvě hlediska – aplikaci různých metod detekce RIL v mléce a mléčných výrobcích a současně rozdělení zodpovědnosti za zdravotní nezávadnost od prvovýroby mléka, zpracovatele až po kontrolu potravin.^14,17,20 Mikrobiologické testy s Bacillus stearothermophillus nebo s jinými mikroorganismy se vyznačují citlivostí k širokému spektru antimikrobiálních látek (β-laktamová antibiotika, sulfonamidy, tetracykliny). Účinné látky nezachytitelné těmito testy je nutné identifikovat pomocí mikrobiologického receptorového testu nebo imunotestu. Totožnost některých inhibičních látek můžeme zjistit identifikačními testy - penicilinázovým testem, testem na přítomnost sulfonamidů s kyselinou p-aminobenzoovou, dále např. Charm-testem. V posledním kroku nacházejí uplatnění fyzikálně-chemické metody umožňující identifikaci hledané sloučeniny a její částečnou nebo exaktní kvantifikaci.²⁰

Metody využívané při kontrole jakosti mléka
Mléko je na přítomnost RIL monitorováno v různých místech výrobního procesu, v prvovýrobě, v mlékárně, v centrálních laboratořích (CL) a státních laboratořích potravinového dozoru (SVÚ), popř. v dalších akreditovaných laboratořích. Sledování RIL můžeme rozdělit na plošné monitorování a cílené vyšetřování. K detekci RIL jsou využívány mikrobiologické metody, identifikační fyzikálně-chemické metody a jejich vzájemné kombinace, ELISA postupy, enzymatické metody, mikrobiologické receptorové metody a další.
Fyzikálně-chemické metody jsou nákladné i časově náročné. Tyto metody jsou určeny především k identifikaci reziduí nebo ke specifickému průkazu určité skupiny léčiv, samostatně při cíleném vyšetřování nebo v návaznosti na předchozí mikrobiologické metody (např. tenkovrstvá chromatografie – TLC, vysokonapěťová gelová elektroforéza - HVELFO, HPLC aj.). Z mikrobiologických metod jsou na SVÚ a v dalších akreditovaných laboratořích uplatňovány základní standardizované metody agarové difuze na plotnách s vizuálním posouzením růstu testačního kmene a odečtením inhibičních zón. V ČR jsou doporučeny dvě metody. Metoda s kmenem Bacillus stearothermophillus var. calidolactis C 953, která vykazuje vysokou detekční citlivost k ß-laktamovým antibiotikům, a čtyřplotnová metoda - standardizovaná difuzní metoda pro detekci a orientační skupinovou identifikaci antibakteriálních látek v surovinách a potravinách živočišného původu.¹⁵
Screeningové mikrobiologické metody nacházejí uplatnění ve státních laboratořích potravinového dozoru i při plošném monitorování. V současné době existuje celá řada komerčně vyráběných diagnostik např. INTEST a INTEST AS (ČR), BR, BR AS test a BR Blue Star (SRN), FDT a STD – ABIOTEST (Polsko), DELVOTEST P a DELVOTEST SP (Holandsko), COPAN TEST KIT (Itálie).³
U mikrometod je spojen princip agarové difuze s redukční nebo acidobazickou změnou barvy indikátoru v důsledku aktivního metabolismu testovacího mikroorganismu v nepřítomnosti inhibiční látky. Rezidua antibiotik a jiných inhibičních látek difundují ze vzorku mléka do reakční agarové směsi na dně jamek nebo zkumavek obsahující testovací mikroorganismus, speciální výživný agar a acidobazický nebo oxidoredukční indikátor růstu. V uvedených testech se jako test-mikroorganismus používá Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C 953, ale indikátory metabolismu se u jednotlivých testů liší. V ČR jsou registrovány dva testy - DELVOTEST a INTEST, které jako indikátor využívají bromkrezolovou červeň. Ve vzorcích bez inhibičních látek se následkem tvorby kyselin změní původní fialové zabarvení agarové půdy na žluté až žlutozelené. U pozitivních vzorků se fialové zabarvení po stanovené inkubaci při 64 °C nemění.³ Výhodou testů je citlivost k širokému spektru antibiotik: ß-laktamovým ATB, tetracyklinům, popř. i k sulfonamidům. Citlivosti jednotlivých testů se liší. U některých mikrobiologických testů je uváděna i citlivost k čisticím a desinfekčním prostředkům. Byla sledována možnost interference těchto prostředků při stanovení reziduí antibiotik v mléce INTESTem. Koncentrace aktivních složek prostředků, které by mohly interferovat při použití testu ke stanovení antibiotik, nejsou v praxi kromě prostředků s kvarterními amonnými bázemi reálné.¹⁹
Jiné rychlé metody zjišťování reziduí antibiotik a sulfonamidů v mléce jsou nevýhodné, protože zpravidla vykazují citlivost pouze k jedné skupině antibiotik. Byla vyvinuta řada testů s citlivostí k -laktamovým antibiotikům – v ČR jsou využívány např. Penzyme test, Delvo-X-Press test, Beta Star test a SNAP BETA LAKTAM test. Citlivost k tetracyklinovým antibiotikům vykazuje např. SNAP TETRACYCLINE test.

Uplatnění screeningových metod v praxi
Prvovýroba mléka: Testem prováděným přímo u léčené dojnice může veterinární lékař nebo zootechnik zkontrolovat hladinu antibiotik po ukončení ochranné lhůty a tím zabránit případnému znehodnocení celé dodávky mléka. Sledování RIL je důležitým kritickým kontrolním bodem (CCP) v systému HACCP v oblasti produkce syrového mléka.¹ V USA byl vypracován HACCP program k prevenci výskytu reziduí antibiotik v mléce zahrnující 10 CCP. Jedním z nich je kontrola mléka na obsah antimikrobiálních látek před zařazením do dodávky.²¹ V prvovýrobě je vhodné vyšetření s pomocí mikrobiologického testu i rychlých skupinových testů. Mikrobiologické testy mohou za určitých okolností vykazovat falešně pozitivní výsledky způsobené interferenčními faktory. Nespecifické látky např. lysozym nebo laktoferin, nacházející se ve vyšších koncentracích v mastitidním mléce a kolostru, mohou být příčinou falešně pozitivních výsledků při vyšetření individuálních vzorků, podobně jako vysoké počty somatických buněk.¹⁸
Mlékárny: Zpracovatelské závody kontrolují surovinu především vyšetřením cisternových vzorků, v případě podezření nebo pozitivního záchytu dohledávají původ inhibice v bazénových vzorcích mléka. Výsledky vyšetření bazénových vzorků mléka na přítomnost RIL v CL slouží mlékárenským závodům spolu s dalšími znaky jakosti jako podklad pro zpeněžování mléka. Ke stanovení RIL v CL se používají vzorky odebrané pro stanovení mikrobiologické kvality mléka.
Je sice patrný klesající trend od roku 1997, avšak 0,38 % pozitivních vzorků z celkového počtu vzorků vyšetřovaných v CL je ve srovnání s vyspělými mlékařskými zeměmi stále vysoký (EU 0,02 - 0,1 %).¹⁶ Ke kontrole cisternových vzorků mléka je vhodné použít rychlé metody stanovení antibiotik v mléce v kombinaci s mikrobiologickými testy. Pozitivní výsledky získané rychlými testy je třeba potvrdit provedením mikrobiologického testu.

Závěr
Problematika stanovení inhibičních látek je stále aktuální. Prevence nálezů RIL v mléce spočívá především v systematické preventivní práci v oblasti prvovýroby mléka. Za důležitá opatření je možné považovat:
- podávání antibiotik cíleně a pod kontrolou veterinárního lékaře,
- označení léčených dojnic,
- informovanost ošetřujícího personálu,
- změny v technologii dojení – léčené dojnice dojit nakonec, vyloučit potrubní dojení, dojit do konví,
- v dojírně léčené dojnice separovat do samostatné skupiny, dojit odděleně, nemísit nádoje,
- výluka mléka léčených dojnic,
- čištění a desinfekce dojících jednotek po každé léčené dojnici,
- kontrola léčených dojnic před obnovením dodávky stájovým testem,
- kontrola cisternových vzorků mléka,
- identifikace a nezaměnitelnost dodavatelů a vzorků,
- laboratorní a praktické dohledání původců příčin RIL,
- penalizace za porušení mléka,
- likvidace mléka s RIL ve spolupráci s kompetentní autoritou.

Příspěvek vznikl za podpory grantu FRVŠ č. 372.

Literatura:
1. Škarda J., Škardová O. Program péče o produkci a zdraví stáda dojnic. Praha ÚZPI Praha, 2000:68.
2. Holec J. Cizorodé látky v mléce. In: Lukášová J. Hygiena a technologie mléka. Brno; VFU Brno, 1999:76-93.
3. Hozová B., Görner F., Sklenárová Z. Novšie poznatky z oblasti stanovenia inhibičných látok v mlieku. Potrav. vědy 199412:489-496.
4. Seydlová R. Inhibiční látky v mléce. Mlékařské listy - zpravodaj 199845:9-10.
5. Holec J. Výskyt inhibičních látek v mléce a jeho hygienická a technologická rizika. In: Sborník k semináři Inhibiční látky v mléce, Rapotín; Výzkumný ústav pro chov skotu, 1994:11-15.
6. Hejzlar M., Hylmar B., Teplý M. Antibiotika a jejich použití v potravinářství a zemědělství. Praha; SNTL, 1980:282.
7. Směrnice 92/46/EHS Rady ze dne 16.června 1992.
8. Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 287/1999 Sb., o veterinárních požadavcích na živočišné produkty
9. ČN 57 05 29 Syrové kravské mléko.
10. Zákon MZ č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích, a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, Zákon MZ č. 306/2000 Sb., kterým se mění zákon č. 110/1997 Sb.
11. Vyhláška MZ č.273/2000 Sb., kterou se stanoví nejvyšší přípustné zbytky veterinárních léčiv a biologicky aktivních látek používaných v živočišné výrobě v potravinách a potravinových surovinách.
12. Vyhláška MZ č. 106/2002 Sb., kterou se mění vyhláška MZ č. 273/2000 Sb.
13. Zákon MZe č. 166/1999Sb., o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů.
14. Honkanen-Buzalski T., Suhren G. Residues of Antimicrobial Agents in Milk and Their Significance to Public Health and Milk Processing. Bulletin of the IDF 345:11-12.
15. Metodický pokyn. Metodika stanovení reziduí inhibičních látek. Referenční laboratoř SVS ČR pro RIL, 1999.
16. Kadlec I. Výsledky hodnocení kvality syrového mléka v CL 1997 – 2001. In: Sborník k semináři Den VÚM. Praha; VÚM, 2002:5-9.
17. TEST KITS. Christian Hansen. First edition. 2001:4.
18. Carlsson A., Bjorck L. Lactoferrin and Lysozyme in Milk During Acute Mastitis and Their Inhibitory Effect in Delvotest P. J Dairy Sci 1989;72:3166-3175.
19. Schlegelová J., Ryšánek D. Detekce čisticích a dezinfekčních prostředků v mléce (INTEST). In: Sborník k semináři Inhibiční látky v mléce. Rapotín; Výzkumný ústav pro chov skotu, 1994:37.
20. Foltys V., Boroš V. Výskyt inhibičných látok v nakupovanom mlieku v SR, možnosti ovplyvnenia technologických vlastností mlieka a vývoj systému na dôkaz inhibičných látok. In: Sborník k semináři Inhibiční látky v mléce. Rapotín; Výzkumný ústav pro chov skotu, 1994:47-53.
21. Sischo M. W. Quality Milk and Tests for Antibiotic Residues. J Dairy Sci 1996;79:1065-1073.

Adresa autora:
MVDr. Pavlína Navrátilová, PhD.
Ústav hygieny a technologie mléka FVHE
Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Palackého 1 – 3
612 42 Brno