LOPATÁŘOVÁ M.,1 KRONTORÁD P.,2 HOLÝ L.,1 ZAJÍC J.1
Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1
Bovet a. s., Sloupnice2
Veterinářství 2006;56:696-699.
SOUHRN
Lopatářová M., Krontorád P., Holý L., Zajíc J. Určení pohlaví raných embryí skotu v podmínkách praxe.
Cílem studie bylo prověření metody sexace sedmidenních morfologicky vhodných embryí skotu a posouzení jejich vývoje po přenosu. Embrya, získaná superovulací, byla vystavena mikrochirurgickému zásahu odnětí několika embryonálních buněk (> 5), které pak byly použity pro analýzu pohlaví. Ošetřená embrya byla uchovávána v kultivačním médiu až do výsledku sexační analýzy (3 – 3,5 hod.). Pohlaví embryí bylo určováno komerční technologií (USA) za použití metody založené na polymerázové řetězové reakci (PCR). Embrya, analyzovaná jako samičí, byla pak přenášena synchronizovaným příjemcům. Pohlaví bylo zkoumáno u 300 embryí, přičemž úspěšně mohlo být stanoveno u 265 zárodků (88,3 %). Pohlaví samčí mírně převažovalo (54 %) nad pohlavím samičím. Po přenosu 122 embryí, diagnostikovaných jako samičí, byla gravidita zjištěna u 69 příjemců (56,6 %). Dosud se narodilo 62 telat, z nichž bylo 58 jaloviček. Přesnost sexační metody dosáhla tedy 93,5 %. Sexace embryí skotu je rychlou a praktickou metodou pro determinaci pohlaví u preimplantačních embryí před jejich přenosem především ve vybraných chovech.
SUMMARY
Lopatářová M., Krontorád P., Holý L., Zajíc J. Determining the sex of early bovine embryos in practical conditions.
The aim of this study was verification of the sexing method in the seven-day-old morphologically suited bovine embryos and appreciation of their survival after transfer. From embryos obtained by superovulation were microsurgically isolated several embryonic cells (> 5) that were then used for sex analysis. Treated embryos were conserved in the cultivation medium till gender analysis result (3 – 3,5 h). Sex of an embryo was assessed by the commercial technology (USA) by means of polymerase chain reaction (PCR). Embryos that were determined as female, were then transmitted to synchronised recipients. Gender was analysed in 300 embryos, while successfully could be established in 265 embryos (88.3 %). Male sex slightly prevailed (54 %) over female. After transfer of 122 embryos diagnosed as the female, a pregnancy was found in 69 recipients (56.6 %). To date, 62 calves were born and 58 of them were heifers. Accuracy of this sexing method reached consequently 93.5 %. Sexing of cattle embryos is a rapid and practical method for gender assessment in preimplantation embryos before their transfer mainly in the selected breeds.
Úvod
Významnou součástí moderního chovu skotu je produkce embryí určeného pohlaví. Diagnostika pohlaví telat již před nastoupením gravidity znamená v rámci rutinního transferu embryí od superovulovaných dárců cílené ekonomické zhodnocení embryonálního genetického potenciálu. Některé oblasti chovu skotu dávají přednost vyšší proporci samčího potomstva, většinou je však preferováno potomstvo samičí vzhledem k tomu, že reprodukční i produkční potenciál stáda je určován stádem krav, jejichž reprodukční kapacita je oproti samcům značně nižší. Tento limitující faktor genetického pokroku1 bude možno překonávat selektivním stanovením pohlaví embrya a tím i budoucího telete. Výhody predikce pohlaví v chovech skotu lze vidět jak ve zvýšené produkci masných a mléčných populací, ve zvýšené selekční intenzitě (až do 15 %), a nakonec i v lepším využití masných a mléčných užitkových kříženců.2 Začlenění biotechnické metody sexace ať už spermií či preimplantačních embryí do systému MOET (Multiple ovulation and embryo transfer) je nejlepší cestou k rychlému zlepšování genetických a produkčních vlastností stáda.
Většina pokusů rozdělit X a Y spermie před inseminací pomocí různých metod (centrifugace, elektroforéza, sedimentace, filtrace, posun pH, změna motility aj.) skončila nezdarem pro nepřesvědčivé a často nereprodukovatelné výsledky. Separace spermií na základě rozdílného množství DNA pohlavních chromozomů (bovinní X chromozom má o 3,8 % více DNA než Y chromozom) pomocí průtokové cytometrické analýzy3 prokázala více než 90 % úspěšnost. Praktické využití této metody je však omezeno,2 protože byla pozorována jak snížená vitalita těchto spermií, tak i zvýšený výskyt embryonální mortality. Slibné jsou však výsledky inseminace jalovic sexovaným čerstvým i zmrazeným semenem, protože přinesly jen malé rozdíly v zabřezávání proti kontrolám.4 Navíc narozená telata ze sexovaných spermií nevykazovala vyšší frekvenci abnormit. I když je tato technologie již na dosah ruky, musí být pro její širší aplikaci méně nákladná a efektivnější.5 Určování pohlaví preimplantačních embryí poprvé provedli Edwards a Gardner v roce 1967 cytogenetickou metodou,6 kde králičí blastocysty byly analyzovány na přítomnost Barrova tělíska. Tento průkaz inaktivního, silně kondenzovaného druhého X chromozomu u samičích jedinců je však nevyužitelný u skotu a jiných potravinových zvířat, protože je překryt silnou vrstvou neprůhledné cytoplazmy. Cytogenetická diagnostika pohlaví u embryí skotu cestou chromozomálního vyšetření je založena na zobrazení submetacentrických pohlavních chromozomů. Imunologické zobrazení pohlavně specifického antigenu nabízí možnost neinvazivního stanovení embryonálního pohlaví, ale je velmi nepřesné. Použití specifických DNA sond pro Y chromozom, ke zjištění samčího pohlaví, je založeno na principu navázání značeného DNA fragmentu na komplementární sekvenci DNA (hybridizace). Přesnost této metody se pohybuje okolo 95 %, analýza však trvá několik dní.7
Všechny výše citované metody jsou málo praktické a pro širší využití v embryotransferu nereálné. Předcházející identifikace bovinního specifického DNA fragmentu a následný vývoj amplifikačních technik pomocí polymerázové řetězové reakce (Polymerase Chain Reaction, PCR) přesunuly však sexování embryí od teoretických úvah do reálné praxe. Tato metoda byla brzy využita i pro diagnostiku pohlaví bovinních embryí8,9.
Vysoká přesnost metody a krátká analyzační doba kolem 3 hod.10,11 umožňují plošné využití metody k sexaci preimplantačních embryí skotu. Současné protokoly PCR ke stanovení embryonálního pohlaví vykazují 92 – 94 % efektivitu a 90 – 100 % exaktnost metody12. Jedinou nevýhodou tohoto typu sexace je extrémně vysoká citlivost PCR a tím i vysoká senzibilita k eventuální kontaminaci.
Cílem naší práce bylo posoudit v podmínkách terénní praxe úspěšnost analýzy pohlaví embryí a jejich vývoj po přenosu do dělohy příjemce.
Materiál a metody
a) Příprava dárkyň a výplach embryí
Embrya dobré morfologické kvality byla získaná superovulací a odběrem embryí od holštýnských dárkyň. Superovulace byla indukována folikostimulujícím hormonem prasečího původu (FSH-p, Folicotropin, Spofa) v kombinaci s luteolytiky.13 Folicotropin byl podáván v osmi injekcích v sestupné řadě a ve 12 hodinových intervalech. Jeho celkové množství činilo 10 – 12 ampulí (21 – 25 mg) na jednu superovulaci. Stimulace byla zahajována mezi 10. a 12. dnem estrálního cyklu a byla podmíněna existencí funkčního a výrazného žlutého tělíska. K vyvolání luteolýzy byl podán syntetický analog prostaglandinu (Oestrophan, Bioveta) v množství 50 mg současně s pátou a šestou dávkou hormonu. Proces oplození ovulovaných oocytů dárkyň garantovaly tři inseminace, někdy zdvojenou dávkou semene, v intervalech po 12 hodinách. První inseminace byla provedena čtvrtý den superovulačního cyklu (první aplikace D0) v odpoledních hodinách. Embrya jsme získávali sedmý den (D7) superovulačního estrálního cyklu transcervikálním výplachem dělohy za použití gravitační metody. Každý roh byl vypláchnut médiem o obsahu 500 ml (uzavřený okruh), přičemž výplašek z obou rohů byl zachycován do sterilních 1L NTS lahví. K výplachu bylo použito solného roztoku pufrovaného fosfáty (PBS, Dulbecco), vyrobeného v laboratoři. Médium bylo obohaceno 1% inaktivovaným fetálním telecím sérem (FCS). Po 20 minutové sedimentaci jsme supernatant odsáli a sediment (60 – 70 ml) jsme rozlili do dvou Petriho misek o průměru 9 cm. Embrya jsme vyhledávali za pomoci stereomikroskopu systematickou vrstevnicovou depistáží. Krátkodobá kultivace byla prováděna v médiu PBS + 10% FCS. Embrya byla rozdělena podle morfologické kvality. Morfologicky vhodné zárodky byly vystaveny mikrochirurgickému zásahu odnětí několika embryonálních buněk (> 5), které pak byly použity pro analýzu pohlaví (obr. 1).
b) Proces sexace, příprava příjemkyň a přenos embryí známého pohlaví
Bezprostředně po zákroku bylo započato s analýzou bioptátu. Ošetřená embrya byla krátkodobě uchovávána v kultivačním médiu až do výsledku analýzy. Pohlaví embryí bylo určováno pomocí komerční technologie14 speciální sexační jednotkou (AB Technology, Inc. Pullman WA, USA), kterou vlastní BOVET a. s. Sloupnice. Separované embryonální buňky byly přeneseny do mikrozkumavek s obsahem krezolové červeni (CRS), která zbarvením potvrdí přítomnost DNA. Komerční YCD (Y Chromosome Determinant) obsahuje dva oligonukleotidy (primery), které ohraničí specifický segment DNA, určený k amplifikaci a hybridizuje na cílové sekvenci, takže pomocí polymerázy (termostabilní Taq polymeráza, pocházející od termofilní bakterie Thermus aguaticus) se uskutečňuje syntéza DNA. Kromě polymerázy a páru primerů je pro provedení metody nutná přítomnost volných nukleotidů pro komplementární vazbu po rozštěpení DNA a další pufrovací substance. Amplifikace DNA sekvence probíhá opakovaným zahříváním a zchlazováním roztoku. Při 95 °C probíhá denaturace DNA, při 55 °C usazení primerů a při 72 °C syntéza DNA. Použití termostabilní polymerázy zaručuje proběhnutí více tříminutových cyklů (asi 30). Každý cyklus znamená zdvojení přítomného specifického DNA fragmentu. Všechny vzorky pak byly přeneseny do specifických jamek agarového plátu. Hledaná DNA byla detekována metodou gelové elektroforézy. Výsledek sexace byl zvýrazněn ultrafialovým světlem po přenesení gelu na transluminátor (obr. 2).
Všechny tyto přístroje jsou součástí přenosné laboratoře. Embrya samičího pohlaví byla přenášena synchronizovaným příjemcům za 3 – 3,5 hodiny od počátku analýzy. Transfer byl prováděn pomocí soupravy Cassou, popř. elastickým přenosovým aparátem do báze děložního rohu ipsilaterálně ke žlutému tělísku. Jako příjemkyně sloužily somaticky a pohlavně zralé, běžným způsobem odchovávané jalovice, synchronizované s pohlavním cyklem dárce za pomoci luteolytik v rozpětí 1 dne. Podmínkou jejich využitelnosti k přenosu byla kontrola říjového cyklu, stupeň synchronie s dárcem a především přítomnost odpovídajícího žlutého tělíska na vaječníku.
Gravidita byla zjišťována sonografickým vyšetřením od 21. dne po přenosu, a dále byla potvrzena rektální palpací od 42 dnů potenciální gravidity. Pohlaví pak bylo registrováno po narození telat.
Výsledky a diskuse
Analýze pohlaví bylo podrobeno 300 čerstvých morfologicky kvalitních zárodků (tab. 1) Pohlaví bylo stanoveno u 265 embryí (88,3 %), analýza byla sporná v osmi případech (2,7 %) a diagnostika nebyla možná u 27 vzorků (9 %). Tab. 2 uvádí, že u úspěšně analyzovaných embryí mírně převažovalo pohlaví samčí ve 54 % (143/265) k pohlaví samičímu ve 46 % (122/265).
Výsledky přenosů embryí určených jako samičích shrnuje tab. 3. Po přenosu 122 embryí byla gravidita potvrzena u 69 zvířat (56,6 %). Po transferu embryí samičího pohlaví (tab. 4) se doposud narodilo celkem 62 telat, z toho bylo 58 jaloviček a čtyři býčci. Přesnost této sexační metody byla stanovena na 93,5 %.
Výsledky přenosů sexovaných embryí velmi dobré kvality dokazují, že šetrné a rychlé odebrání několika buněk z embrya neovlivňuje jeho další viabilitu, protože výška koncepce (56,6 %) je srovnatelná s úrovní přenosů embryí neznámého pohlaví. Obdobné výsledky uvádějí Taneja et al. (1998)15 a Lopes et al. (2001)12. Úspěšnost sexace pomocí PCR ve výši 93,5 % byla stejná jako u Shea (1999),16 který 92,7 % přesnost metody prokázal sonograficky na větším počtu plodů (204/220). Taneja et al. (1998)15 popisují exaktnost metody až do výše 97,4 %.
Závěr
Sexace embryí skotu pomocí polymerázové řetězové reakce je praktickou metodou pro determinaci pohlaví u embryí před jejich přenosem, především ve vybraných chovech skotu s cílem produkce většinou samičího, ale i samčího potomstva. Diagnostika je oproti jiným metodám proveditelná v terénní praxi, je relativně rychlá (3,5 hod.) a přesná (> 93 %). Náklady na určení pohlaví jednoho embrya nepřesahují 1 500 Kč.
Zpracováno za podpory výzkumného záměru MŠM 6215712403.
Literatura:
1. Heer C. M., Reed K. C. Micromanipulation of bovine embryos for sex determination. Theriogenology 1991;35:45-54.
2. Niemann H., Meinecke B. Embryotransfer und assoziierte Biotechniken bei landwirtschaftlichen Nutztieren. Stuttgart; Ferdinand Enke Verlag, 1993:158.
3. Johnson L.A. Gender preselection in domestic animals using flow cytometrically sorted sperm. J Anim Sci 1992;70 (Suppl. 2):8-18.
4. Seidel G. E. Jr., Schenk J. L., Herickhoff L. A., Doyle S. P., Brink Z., Green R. D. et al. Insemination of heifers with sexed sperm. Theriogenology 1999;52:1407-1420.
5. Seidel G. E. Jr., Johnson L. A. Sexing mammalian sperm – overview. Theriogenology 1999;52:1267-1272.
6. Edwards R. G., Gardner R. L. Sexing of live rabbit blastocyst. Nature 1967;214:576-577.
7. Leonhard M., Korszenbaum M., Cotinot C., Chesné P., Heyman Y., Stinnakre M. G., et al. Sexing bovine embryos using Y chromosome specific DNA probe. Theriogenology 1987;27:248.
8. Reed K. C., Matthews M. E., Jones, M. A. Sex determination in ruminants using Y-chromosome specific polynucleotides. Published patent application. Patent cooperative treaty No. WO88/01300,1988.
9. Herr C. M., Holt N. A., Matthae K. I., Reed K. C. Sex of progeny from bovine embryos sexed with a rapid Y-chromosome – detection assay. Theriogenology 1990;33:247.
10. Thibier M., Nibart M. The sexing of bovine embryos in the field. Theriogenology 1995;43:71-80.
11. Bredbacka P., Velmala R., Peippo J., Bredbacka K. Survival of biopsied and sexed bovine demi-embryos. Theriogenology 1994;41:1023-1031.
12. Lopes R. F. F., Forell F., Oliveira A. T. D., Rodriques J. L. Splitting and biopsy for bovine embryo sexing under field conditions. Theriogenology 2001;56:1383-1392.
13. Holý L., Lopatářová M., Krontorád P., Holý J. Systematische Anwendung des Embryotransfers beim Rind unter den Bedingungen großer Tierkonzentrationen. Mh Vet Med 1990;45:409-413.
14. Herr C. M., Steel T., Lascelles A., Reed K. C. Instruction manual: Splitting, biopsy & rapid sexing of cattle embryos. AB Technology, Inc., 1995:58.
15. Taneja M., Rao K. B. C. A., Gangawane S., Zawar S. G., Totey S. M. Rapid sexing of bovine preimplantation embryos using polymerase chain reaction: production of calves with predetermined sex under field conditions. Ind J Exp Biol 1998;36:1201-1208.
16. Shea B. F. Determining the sex of bovine embryos using polymerase chain reaction results: a six-year retrospective study. Theriogenology 1999;51:841-854.
Adresa autora:
Doc. MVDr. Miloslava Lopatářová, CSc.
Klinika chorob přežvýkavců, oddělení reprodukce
Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Palackého 1 – 3
612 42 Brno
e-mail: lopatarovam@vfu.cz
