Vplyv imunostimulácie levamizolom na niektoré ukazovatele imunity u hovädzieho dobytka

M. MAĎAR,¹ Š. ŠVRČEK,¹ Š. PAULÍK,² J. MOJŽIŠOVÁ,² R. FRANKA,¹ R. HROMADA,² J. ZÁVADOVÁ,¹ R. ONDREJKA,² A. ONDREJKOVÁ,² J. SÜLI,² Z. BENÍŠEK²
1Univerzita veterinárskeho lekárstva, Výskumný ústav veterinárskej medicíny Košice, 2Univerzita veterinárskeho lekárstva Košice
Veterinářství 2002; 52:562-566

SÚHRN
Maďar M., Švrček Š., Paulík Š., Mojžišová J., Franka R., Hromada R., Závadová J., Ondrejka R., Ondrejková A., Süli J., Beníšek Z. Vplyv imunostimulácie levamizolom na niektoré ukazovatele imunity u hovädzieho dobytka. Veterinářství 2002; 52:562-566.
V terénnych pokusoch sme sledovali vplyv podania levamizolu na niektoré imunologické funkcie hovädzieho dobytka rôznych vekových kategórií v dvoch veľkochovoch v okrese Košice-okolie (u 144 dojníc a 196 kusov mladého hovädzieho dobytka). Dve (bežné antihelmintické) dávky levamizolu podané s odstupom piatich dní zvyšovali u všetkých vekových kategórií hovädzieho dobytka sledované ukazovatele celulárnej imunity – reakciu pri kožnom teste oneskorenej precitlivelosti s dinitrofluórbenzénom (DNFB), fagocytárnu aktivitu a fagocytárny index leukocytov periférnej krvi. Imunostimulácia priaznivo ovplyvnila výskyt mastitíd u dojníc, respiračného a diarrhoického syndrómu u mladého hovädzieho dobytka. Ekonomický efekt pri aplikácii 72 ks dojniciam a 98 ks teľatám bol vyčíslený približne na 65 000 Sk.

SUMMARY
Maďar M., Švrček Š., Paulík Š., Mojžišová J., Franka R., Hromada R., Závadová J., Ondrejka R., Ondrejková A., Süli J., Beníšek Z. The effects of Levamisole immunostimulation upon some immune functions in cattle. Veterinářství 2002; 52:562-566.
In field experiments studying the effects of levamisole administration upon some immune functions in cattle of different age categories were conducted. In all age categories of cattle two (standard antihelminthic) doses of levamisole administered at an interval of 5 days increased the indices of cellular immunity under observation: the reaction during the skin test of delayed type hypersensitivity with dinitrofluorobenzene (DNFB), the phagocytary activity and the phagocytary index of peripheral blood leucocytes. The economic effect of application in 72 dairy cows and 98 calves was estimated as about 65 000 Sk.

Levamizol, L-forma tetramizolu, bol pôvodne vyvinutý ako antiparazitikum. Je to jedna z prvých syntetických látok s imunomodulačným účinkom. Od r. 1971, keď Renoux a Renoux popísali zvýšenú protekciu proti čelenži B. abortus u vakcínovaných myší, ktorým podali tetramizol, stala sa táto látka predmetom intenzívneho výskumu a klinických overovaní z hľadiska imunofarmakológie.¹ Výsledky prác mnohých autorov potvrdili schopnosť levamizolu stimulovať niektoré imunologické funkcie, prevažne celulárnej zložky imunity.^2-4 V našich predchádzajúcich prácach⁵ sme zaznamenali priaznivý vplyv imunomodulácie levamizolom na zdravotný stav teliat pri respiračnom syndróme. Pri antirabickej vakcinácii autor popísal po aplikácii levamizolu zvýšenú protekciu proti čelenži u myší a vyššie hladiny protilátok u hovädzieho dobytka.⁶
V predkladanej práci prezentujeme výsledky terénnych pokusov - vplyv podania levamizolu v dvoch dávkach na niektoré imunologické ukazovatele u hovädzieho dobytka rôznych vekových kategórií; na chorobnosť a vyčísľujeme ekonomickú efektívnosť.

Materiál a metodika
Prvá etapa pokusov bola vykonaná na hovädzom dobytku - krížencoch z chovov dvoch poľnohospodárskych družstiev v okrese Košice-okolie (PD Čečejovce a PD Paňovce), v celkovom počte 90 zvierat.
V pokuse bol použitý komerčný injekčný prípravok Bioverm, č. šarže 746005, v súčasnosti používaný v hlavnej indikácii ako antihelmintikum pri gastrointestinálnych a pľúcnych nematodózach. Všetkým zvieratám, ktoré boli ošetrené levamizolom, boli aplikované 2 dávky (7,5 mg/kg ž. hm., u zvierat s hmotnosťou nad 300 kg celková jednotlivá dávka levamizolu bola 2,25 g) s odstupom päť dní subkutánne v oblasti lopatky. Použité dávky sú zhodné s bežne používaným dávkami levamizolu ako antiparazitika.
Úroveň nešpecifickej celulárnej imunity bola stanovená intradermálnym testom oneskorenej precitlivelosti s použitím dinitrofluórbenzénu (DNFB) podľa Paulíka a kol.⁵ Test využíva alergiu oneskoreného typu na syntetickú látku (v prírode sa nevyskytujúcu). Opakované (po senzibilizácii) vnútrokožné podanie vyvoláva reakciu prejavujúca sa opuchom v mieste aplikácie. Hodnota reakčného čísla je priamo úmerná aktuálnej úrovni nešpecifickej celulárnej imunity testovaného zvieraťa.
Úroveň nešpecifickej humorálnej imunity bola kvantifikovaná ako koncentrácia celkových sérových imunoglobulínov podľa McEwana a kol.⁷
Pre stanovenie fagocytárnej aktivity a fagocytárneho indexu neutrofilných granulocytov a monocytov bol použitý test fagocytózy mikrosférických hydrofilných partikúl MSHP.⁸ Test umožňuje stanoviť fagocytárnu aktivitu – FA (t. j. percento fagocytujúcich buniek) a fagocytárny index – FI (t. j. ingesčnú schopnosť) leukocytov periférnej krvi.

Schéma pokusu
1. Dojnice stojace na sucho (skupina D)
Bolo vybratých 30 kusov dojníc približne 6 týždňov pred pôrodom. Zvieratá boli na základe výsledkov testov nešpecifickej imunity rozdelené do 2 analogických podskupín:
a) pokusnej - 15 kusov dojníc, ktorým sme aplikovali levamizol v dvoch dávkach ako bolo uvedené;
b) kontrolnej - 15 kusov dojníc bez ošetrenia levamizolom.
U zvierat z obidvoch podskupín sme sledovali zmeny v horeuvedených ukazovateľoch celulárnej a humorálnej nešpecifickej imunity.
2. Teľatá v ranom postnatálnom období (skupina T1)
Bolo vybratých 20 kusov teliat do 14 dní života. Na základe výsledkov testov imunokompetencie boli teľatá rozdelené do 2 analogických podskupín:
a) pokusnej - 10 kusov teliat, ktorým sme aplikovali levamizol ako bolo uvedené;
b) kontrolnej - 10 kusov teliat bez ošetrenia levamizolom.
U zvierat z uvedených podskupín sme sledovali zmeny v horeuvedených ukazovateľoch imunity.
3. Teľatá pred odstavom (skupina T2)
4. Teľatá po odstave (skupina T3)
U týchto kategórií teliat boli počet a rozdelenie do skupín rovnaké ako pri teľatách v skupine T1.
Po vytvorení skupín všetkých vekových kategórií zvierat na základe výsledkov dvoch testov imunokompetencie - intradermálneho testu oneskorenej precitlivelosti s DNFB a koncentrácie celkových sérových imunoglobulínov - bol zvieratám v pokusných skupinách všetkých vekových kategórií aplikovaný levamizol v dávke 7,5 mg/kg - 0. deň. Na piaty deň sme zopakovali aplikáciu levamizolu a odobrali krv pre kvantifikáciu celkových sérových imunoglobulínov a fagocytárnej aktivity, 14. deň - odber krvi ako na 5. deň; 29. deň - DNFB test - provokácia (čelenž); 30. deň - odčítanie reakcie a odber krvi ako na 5. deň; 59. deň - DNFB test - čelenž a 60. deň - odčítanie reakcie a odber krvi ako na 5. deň.
V 2. etape pokusov (vykonaných v rovnakých chovoch hovädzieho dobytka, ako v 1. skupine pokusov) sme levamizol aplikovali 57 dojniciam a 68 teľatám; rovnaký počet dojníc a teliat slúžil ako kontrola (bez imunostimulácie). U všetkých zvierat, ktorým bol podaný levamizol a neošetrených zvierat analogických kontrolných skupín sme sledovali niektoré zverozdravotné a chovateľské parametre. Klinické pozorovania u dojníc sme zamerali na výskyt mastitíd po pôrode, u teliat na poruchy dýchacieho a tráviaceho aparátu. Z chovateľských parametrov sme sledovali dojivosť a hmotnostné prírastky teliat.

Výsledky
V prezentovanej práci sme zaznamenali imunostimulačný účinok levamizolu na celulárnu imunitu pri dvojrazovom podaní antihelmintickej dávky s odstupom 5 dní. Výsledky sú zhrnuté v tabuľkách I, II a III.
V kontrolných podskupinách sme nezistili signifikantné rozdiely vo výsledkoch vyšetrení uvedených ukazovateľov celulárnej imunity v jednotlivých dňoch pokusu; základom pre štatistické vyhodnotenie boli hodnoty namerané v deň 0.
Reakčné čísla pri kožnom teste oneskorenej precitlivelosti boli signifikantne zvýšené v pokusných podskupinách zvierat T1 a T2 na 30. deň , v pokusných podskupinách T3 a D na 30. deň a 60. deň pokusu (p
Fagocytárna aktivita bola štatisticky významne zvýšená vo všetkých pokusných podskupinách na 5., 14. a 30. deň (p
Fagocytárny index vykazoval signifikantné zvýšenie vo všetkých pokusných podskupinách na 5., 14. a 30. deň (p
Podanie levamizolu v našich pokusoch nevyvolalo štatisticky preukazné zmeny hodnôt nešpecifickej humorálnej imunity, kvantifikovaných turbidimetricky ako koncentrácia celkových sérových imunoglobulínov.
Chorobnosť v jednotlivých kategóriách zvierat hodnotíme nasledovne: u dojníc ošetrených levamizolom a ich teliat v obidvoch chovoch sme nezaznamenali úhyny, mastitídy, nevyhnutné zabitia alebo ochorenia vyžadujúce liečebný zásah. Naproti tomu v kontrolnej podskupine sme zaznamenali za sledované obdobie 31 prípadov liečených klinických foriem mastitíd.
Teľatá všetkých vekových kategórií počas pokusnej fázy (zimné obdobie) prejavovali príznaky respiračného syndrómu a porúch tráviaceho aparátu. Počet postihnutých zvierat bol signifikantne vyšší u podskupín zvierat bez podania levamizolu, taktiež symptómy boli výraznejšie. V kontrolných podskupinách za sledované obdobie uhynulo celkom 5 teliat.
Dojivosť (pri rovnakom prísune živín) vzrástla u levamizolom ošetrenej podskupiny zvierat oproti kontrole v priemere približne o 90 l/rok/kus.
Hmotnostné prírastky u levamizolom ošetrených teliat sa zvýšili priemerne o 0,03 kg/deň/kus.
Na základe aktuálnych cien (rok 2000) boli zisky z vykonanej imunostimulácie obidvoch PD po odpočítaní našich nákladov vyčíslené približne na 65 000 Sk.

Diskusia a záver
Cieľom predmetnej práce bolo v praktických podmienkach v dvoch veľkochovoch overiť možnosti využitia imunostimulácie levamizolom pre zvýšenie nešpecifickej obranyschopnosti a zníženie chorobnosti hovädzieho dobytka rôznych vekových kategórií. Imunostimulačný efekt bol kvantifikovaný 4 imunologickými metódami, z toho 3 laboratórnymi a 1 terénnym testom. Taktiež sledovaná chorobnosť a niektoré chovateľské parametre. U levamizolom ošetrených zvierat boli zaznamenané zvýšené hodnoty ukazovateľov nešpecifickej celulárnej imunity. Ukazovateľ humorálnej imunity - celkový obsah imunoglobulínov v krvnom sére - nebol signifikantne ovplyvnený. Na základe klinicko-epizootologických pozorovaní je možné súdiť o zvýšení obranyschopnosti levamizolom ošetrených zvierat, čo sa prejavilo o. i. znížením frekvencie výskytu ochorení respiračného komplexu a porúch gastrointestinálneho aparátu u teliat a znížením výskytu mastitíd u dojníc. Tiež z ekonomického aspektu je možné ošetrenie hovädzieho dobytka levamizolom hodnotiť pozitívne.
Napriek rozsiahlemu výskumu mechanizmus imunostimulačného účinku levamizolu zostáva až dodnes neúplne definovaný. Je známe, že ovplyvňuje rôzne funkcie T-lymfocytov, makrofágov a polymorfonukleárnych leukocytov.^9,10 Predpokladá sa, že levamizol pôsobí aj ako inhibítor produkcie, alebo činnosti endogénneho imunosupresívneho lymfokínu, označovaného ako SIRS (soluble immune response suppressor). Tento je produkovaný T-supresor bunkami a získava imunosupresorickú aktivitu po konverzii na oxidovanú formu. Levamizol blokuje túto konverziu, takže dochádza k „desupresii“ imunitných procesov a zvýšeniu funkčnej aktivity T buniek a fagocytov.¹¹
Levamizol ovplyvňuje tak bunečnú, ako aj humorálnu imunitnú odpoveď.¹² Zatiaľ čo bunkou sprostredkovaná imunitná odpoveď je levamizolom ovplyvňovaná aktiváciou fagocytov a T-lymfocytov,¹⁰ humorálnu odpoveď moduluje nie priamym účinkom na B-lymfocyty, ale pôsobením na makrofágy a T-lymfocyty.¹³ Vylúčenie priameho efektu levamizolu na B-lymfocyty umožňujú aj zistenia o indukcii syntézy nukleových kyselín a proteínov pri T, ale nie B-lymfocytoch stimulovaných mitogénmi a antigénmi, alebo o indukcii prepojenia IgM na IgG, ktoré je pod vplyvom T helper buniek.¹⁴ Levamizol indukuje diferenciáciu nezrelých buniek do funkčne zrelých T-lymfocytov. Potencovanie maturácie T-lymfocytov sa odzrkadľuje reštauráciou tvorby E roziet pri ich zníženom počte.¹⁰
Stimulácia kvantitatívneho zastúpenia T-lymfocytov levamizolom, hodnotená E rozetovou metódou, bola zistená tiež u hovädzieho dobytka.⁵ Levamizol zvyšuje blasttransformačnú odpoveď lymfocytov hovädzieho dobytka pri indukcii mitogénmi, alebo špecifickými antigénmi.¹⁵ Monocyt – makrofág je nevyhnutný pre optimálnu antigénom alebo mitogénom indukovanú transformáciu T-lymfocytov a produkciu lymfokínov.¹⁶ Levamizol zvyšuje interakciu krvných monocytov s T-lymfocytmi (čo môže tiež prispieť k jeho účinku na uvedené aktivity T-lymfocytov).
Levamizol preukázal potencujúce účinky aj na niektoré funkcie fagocytov. Mobilitu granulocytov a monocytov zvyšuje tak u zdravých, ako aj chorých jedincov. Reštauruje poškodenie chemotaxie fagocytov¹⁷ a ovplyvňuje ingesčnú kapacitu neutrofilov a makrofágov. Uvedené stimulačné účinky levamizolu na fagocyty sú sprostredkované cez ich povrchové receptory.
Účinok levamizolu na humorálnu imunitnú odpoveď je variabilný a závisí na jeho dávke a časovej schéme aplikácie, ako aj od imunokompetencie hostiteľa a povahy stimulujúceho antigénu.
Z klinických pozorovaní u hospodárskych zvierat vyplýva, že levamizol bol s pozitívnym efektom použitý napr. u svíň domácich v období juvenilnej imunoinkompetencie a v čase odstavu ako prostriedok redukujúci stresom indukovanú imunosupresiu;¹⁸ u hovädzieho dobytka v prevencii mortality fétov, alebo hnačiek a mortality novonarodených teliat prostredníctvom kolostra od kráv ošetrených levamizolom počas obdobia zasušenia;¹⁹ v prevencii výskytu klinických a subklinických mastitíd;²⁰ v profylaxii metritíd; v redukcii výskytu ochorení respiračného komplexu;²¹ v zvýšení odolnosti proti salmonelovej infekcii²² a pri vakcinácii proti IBR.15 Aj v aktuálne uverejnenej práci bola imunomodulácia levamizolom úspešne použitá pre zníženie mortality prasiatok s nízkou pôrodnou hmotnosťou.²³ Imunomodulačný účinok levamizolu pravdepodobne závisí od funkčného stavu imunity, použitej dávkovej a časovej schémy aplikácie.²⁴ Výsledky našej práce potvrdzujú imunostimulačný efekt levamizolu na celulárnu zložku imunity pri jeho aplikácii v dvojrazovej dávke 7,5 mg/kg s odstupom 5 dní.

Literatúra:
1. Renoux G., Renoux M. Effect immunostimulant d’un imidothiazole dans l’immunisation des souris contre l’infection par Brucella abortus. C R Acad Sci, 272 D, 1971:349.
2. Gjulling E. V. Perspektivy primenenija Levamizola pri lečenii infekcioznych i alergičeskych zabolevanij. Imunologija i alegija. Resp mežduved sb. 1983;17:10-15.
3. Hanson K. A., Nagel D. L., Heidrick M. L. Immunomodulatory action of Levamisole-I. Structural analysis and immunomodulating activity of Levamisole degradation products. Inf J Immunopharmac 1991;13:655-668.
4. Hanson K. A., Heidrick M. L. Immunomodulatory action of Levamisole-II. Enhacement of concanavalin A response by Levamisole is associated with an oxidation degradation product of Levamisole formed during lymphocyte culture. Inf J Immunopharmac 1991;13: 669-676.
5. Paulík Š., Švrček Š., Beníšek Z., Húska M., Ďurove A. Využitie kožného testu pre hodnotenie aktuálnej úrovne celulárnej imunity a jej úrovne po experimentálnej aplikácii glukánu a levamizolu u výkrmových býčkov. Vet Med – Czech 1992;37(4):203-212.
6. Maďar M. Imunomodulácia pri rabickej infekcii a antirabickej imunite. Kand diz práca, VŠV Košice, 1984:140 s.
7. McEwan A. D., Fisher E. W., Selman J. E., Penhale W. J. A turbidity test for the estimation of immune globulin levels in neonatal calf serum. Clin chim Acta 1970;27:155-163.
8. Větvička B., Fornůsek I., Kopeček J., Kamínková J., Kašpárek I., Vránová M. Phagocytosis of human leukocytes: A simple micromethod. Immunol Lett 1982;5:97-100.
9. Symoens J., Rosenthal M. Levamisole in the modulation of the immune response; the current experimental and clinical state. J reticuloendothelial Soc 1977;21:175-221.
10. Symoens J., Rosenthal M., De Brabander M., Goldstein G. Immunoregulation with levamisole. Springer Semin Immunopathol 1979;2:49-68.
11. Van Wauwe J., Janssen P. A. J. Review article on the biochemical mode of action of Levamisole: an update. Int J Immunopharmacol 1991;13:3-9.
12. Krasnikov G. A., Cymbal A. M., Klenina N. V., Žnavlev V. M., Sosa N. N. Vlijanije immunomoduljatorov na immunnyje sistemy teljat pri bronchopnevmonii. Veterinarija 1989;12:30-32.
13. Kelly M. T. Modulation of macrophage function by Levamisole. J Reticuloendothel Soc 1978;21:175-221.
14. Renoux G., Renoux M. Restauration par le phenylimidothiazole de la résponse imunologique des souris agées. C R Acad Sci, 274 D, 1971:3034-3035.
15. Babiuk L. A., Misra V. Levamisole and bovine immunity: in vitro and in vivo effects on immune responses to herpesvirus immunisation. Can J Microbiol 1981;27:1312-1319.
16. Antczak D. F., Gorman N. T. Cellular interaction in immune responses. In: Halliwel, R. E. W., Gorman, N. T.: Veterinary clinical immunology. Philadephia; W. B. Saunders, 1989:107-134.
17. Groveman D. S., Borden E. C. In vitro and in vivo effects of Levamisole on monocyte chemotaxis in normal donors and patients with colorectal carcinoma. J Biol Resp Mod 1983;2:167-174.
18. Hennesy K. J., Blecha F., Follman D. S., Kluber E. F. Isoprinosine and Levamisole immunomodulation in artificially reared neonatal pigs. Am J Vet Res 1987;48:477-480.
19. Flesh J., Ovadia H., Nelken D. Increased survival rate in calves fed colostrum from levamisole treated cows. Ref Vet 1977;34:97.
20. Flesh J., Harel W., Nelken D. Immunopotentiating effects of levamisole in the prevention of bovine mastitis, fetal death and endometritis. Vet Rec 1982:56-57.
21. Slanina L., Paulík Š., Dubaj J., Széchenyi Š., Gregor I. Algalev inj. u. vet. Prípravok na stimuláciu imunodeficiencií pri hospodárskych zvieratách. Záverečná správa, VHČ č. 2/1985-86. VŠV Košice, 1986:144 s.
22. Steinbach G., Müller G., Meyer H., Liebrmann H., Selbitz H. J. Zur problematik der unspezifischen Stimulierung der Erregerabwehr bei lendwirtschaftlichen Nutztieren. Nh. Vet Med 1991;46:198-200.
23. Gertenbach J. W., Bilkei G.: Immunomodulation der untergewichtigen Saugferkel mit Levamizol – eine mögliche Methode für Minderung der Saugferkelverluste. Tierärztl Umschau 2002;57:202-206.
24. Brunner C. J., Muskoplat C. C. Immunomodulatory effects of levamisole. JAVMA 1980; 176:1159-1162.

Práca bola uskutočnená v rámci projektu VU RVT-27-25 Systémové veterinárne prístupy ekologizácie chovu zvierat a zvyšovanie hygienickej kvality produktov.

Adresa autora:
MVDr. Milan Maďar, PhD.
Univerzita veterinárskeho lekárstva
Výskumný ústav veterinárskej medicíny
Komenského 73
041 81 Košice