G. BOŘILOVÁ, I. SVOBODOVÁ, I. STEINHAUSEROVÁ, L. GALLAS
Fakulta veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
Veterinářství 2008;58:721-725.
SOUHRN
G. Bořilová, I. Svobodová, I. Steinhauserová, L. Gallas Výskyt vybraných intestinálních patogenů u jatečných kuřat.
Cílem této práce bylo posouzení výskytu intestinálních patogenů Campylobacter spp., Clostridium perfringens a Helicobacter pullorum v trávicím traktu jatečných kuřat pocházejících z konvenčních farem s intenzivním typem výkrmu v České republice. Campylobacter spp. byl prokázán v trávicím traktu 78,21 % vyšetřených brojlerů, přičemž jako dominantní species byl potvrzen C. jejuni (60,94 %). Promořenost jednotlivých farem se pohybovala v rozmezí od 22,5 % do 100 %. Makrorestrikční analýza izolátů C. jejuni prokázala genetickou variabilitu patogena mezi jednotlivými farmami, ale vysokou míru příbuznosti klonů uvnitř farmy. Nicméně v jednotlivých následných hejnech na téže farmě byly potvrzeny nepříbuzné genotypy C. jejuni svědčící o různých zdrojích infekce na dané farmě. Celkem 78,57 % farem bylo pozitivních také na přítomnost Clostridium perfringens, přičemž všechny získané izoláty byly potvrzeny jako typ A a 6,82 % z nich neslo gen cpb2 pro produkci β2 toxinu. Přítomnost nově specifikovaného intestinálního patogena Helicobacter pullorum byla prokázána na 53,8 % farem. Z výsledků studie je zřejmé, že promořenost chovů brojlerových kuřat epidemiologicky významnými patogeny je vysoká a měla by být přijata a zavedena opatření vedoucí k jejich eliminaci na farmách.
SUMMARY
G. Bořilová, I. Svobodová, I. Steinhauserová, L. Gallas Prevalence of selected intestinal pathogens in broiler chickens.
The aim of this study was the evaluation of the prevalence of foodborne intestinal pathogens Campylobacter spp., Clostridium perfringens and Helicobacter pullorum in the gastrointestinal tract of broiler chickens from the conventional farms with intensive production in the Czech Republic. Prevalence of Campylobacter spp. in caecum of broilers was 78.21% with predominant species C. jejuni (60,94%). The flock prevalence ranged from 22.5% to 100%. Macrorestriction analysis by PFGE after SmaI digestion showed that genotypes of clones in one flock are the same or close by related. Flocks from various farms are mostly infected with nonrelated clones, but also on one farm the following flock may be contamined with nonrelated C. jejuni strains. Clostridium perfringens was detected on the 78.57 % of the investigated farms. All C. perfringens isolates were classified as type A (detection of cpa gene) and 6.82% of isolates were positive for the cpb2 gene associated with enterotoxin. From 13 conventional farms 53.8% were positive for the presence of new emerging patogen Helicobacter pullorum. This study confirmed high prevalence of foodborne pathogens Campylobacter spp., Clostridium perfringens and Helicobacter pullorum on the broiler farms with intensive production in the Czech republic. These facts might be important for the adoption and acceptance of the elimination programs.
Úvod
Počet hlášených bakteriálních alimentárních infekcí a intoxikací v zemích Evropské unie má stále vzrůstající tendenci.1 Velká část kontaminantů mikrobiálního původu přichází do zpracovatelských podniků z prvovýroby (farmy, chovy). Z těchto důvodů byla tato práce zaměřena na studium výskytu Campylobacter spp., Clostridium perfringens a Helicobacter pullorum v intestinálním traktu brojlerových kuřat pocházejících z konvenčních farem v České republice.
Drůbež představuje jeden z přirozených rezervoárů termofilních Campylobacter spp. V Evropě2-4 je výskyt udávaný na farmách chovajících brojlery variabilní a pohybuje se od 0,2 % do 92 % přičemž nejnižší výskyt je udáván v severských státech např. Norsko, Finsko a Litva.1 Nejčastějším druhem kolonizujícím trávicí trakt drůbeže, a také potvrzeným hlavním původcem humánních gastrointestinálních infekcí – kampylobakterióz, je C. jejuni. Četné studie5,6 uvádějí, že míra infekce Campylobacter spp. v konvenčních chovech vzrůstá úměrně s délkou odchovu brojlerových hybridů. Dojde-li k výskytu patogena u minimálního počtu jedinců, dochází k rychlému rozšíření, přičemž první kultivovatelné kmeny jsou izolovány ve třetím týdnu věku zvířat. Postupně dochází k infikaci téměř všech, nebo všech brojlerů v hejnu a také ke kontaminaci prostředí ve kterém se zvířata nacházejí. Kolonizace drůbežího střeva zpravidla začíná ve druhém týdnu věku a promořenost chovu stoupá s věkem drůbeže a stagnuje v okamžiku dosažení tržního věku, který se pohybuje mezi pěti až sedmi týdny.5 Hlavním mechanismem kolonizace hejn drůbeže rodem Campylobacter je horizontální transfer, zřejmě z environmentálních zdrojů (např. krmivo, neošetřená voda, ostatní hospodářská zvířata, divoké ptactvo nebo zařízení farmy). Kontrola a prevence na úrovni farem představují významný faktor v redukci výskytu Campylobacter spp. na opracované drůbeži a drůbežím mase a přispívají tak velkou měrou k eliminaci tohoto patogena v potravinovém řetězci. Jelikož hlavní zdroj infekce brojlerových hejn nebyl zatím přesně označen, je prevence na farmách velmi obtížná. Protože je přenos Campylobacter spp. v hejnech velmi rychlý a není zásadně ovlivněn dobrými nebo špatnými hygienickými podmínkami v chovu, jeví se pro úspěšnou eliminaci patogena na konvenčních drůbežích farmách jako zásadní prevence kolonizace prvního jedince v hejnu.7
Clostridium perfringens patří mezi ubikvitárně se vyskytující bakterie tvořící spory. Produkce toxinů a tvorba spor byly hlavními faktory, na jejichž základě byl tento druh zařazen mezi patogenní mikroorganismy. Toxiny α, β, ε, a ι jsou považovány za hlavní, podle nichž byl celý druh rozdělen na typy A, B, C, D a E. Ostatní toxiny, z nichž největší význam mají enterotoxin a nedávno objevený β2 toxin jsou označeny za méně důležité. Pro ptáky jsou patogenní typy A a C C. perfringens. Typ A produkuje pouze α toxin, z vedlejších toxinů může být zastoupen β2 toxin a enterotoxin. Typ A může vyvolat také onemocnění u lidí, jeho průběh však bývá většinou mírný. Typ C je producentem α a β toxinů, opět může produkovat jak enterotoxin, tak β2 toxin. V nízkých hladinách (103 – 104 cfu/g) je C. perfringens typu A běžnou součástí trávicího traktu drůbeže s největším zastoupením ve slepých střevech. Přenos mikroorganismů mezi jednotlivými ptáky se děje cestou horizontální. Díky značné odolnosti spor vůči vysokým teplotám i dezinfekčním prostředkům je eliminace patogena z prostředí výkrmových hal obtížná. Kolonizace střeva začíná od prvního dne stáří, ke vzniku onemocnění dochází vlivem ostatních spolupůsobících faktorů – stres, změna krmiva, interkurentní infekce – zejména kokcidióza, které vyvolávají celkovou alteraci zdravotního stavu. Nekrotická enteritida je multifaktoriální střevní onemocnění, ekonomicky významné zvláště u brojlerových kuřat a může probíhat jako akutní vzplanutí projevující se vodnatým průjmem, tvorbou difterických membrán nebo pseudomembrán s výskytem okolo 17. dne stáří a celkovým úhynem až 40 %. Počet C. perfringens se pohybuje v hladinách 107 – 108 cfu/g. Forma subklinická má podobný ekonomický dopad, ztráty jsou způsobeny prodlužující se dobou výkrmu.8
Rod Helicobacter spp. byl nově vytvořen a vyčleněn z rodu Campylobacter spp. v roce 1989. V současné době je známo celkem 26 druhů, které se dělí podle místa výskytu na druhy gastrické a enterohepatické (EHS). Kritériem rozdělení je schopnost produkovat enzym ureázu, díky níž gastrické druhy přežívají v silně kyselém prostředí žaludku. Enterohepatické druhy jsou nalézány u lidí, savců a ptáků v játrech a celém trávicím traktu, vyjma žaludku. Infekce EHS jsou spojeny s onemocněním trávicího traktu a hepatobiliárními poruchami, u některých zástupců byl prokázán zoonotický potenciál. Přenos EHS druhů fekálně-orální cestou mezi zvířaty je pouze hypotetický. Helicobacter pullorum byl dosud izolován ze tří různých zdrojů: slepého střeva brojlerových kuřat bez klinických známek onemocnění, střeva a jater slepic s patoanatomickým nálezem pokládaným za vibrionickou hepatitidu a z klinických vzorků pacientů s průjmovým onemocněním. U člověka je pokládán za patogenní, jelikož vyvolává gastroenteritidy nebo poškození jater. Úzce příbuzným druhem k H. pullorum je Helicobacter canadensis, který byl identifikován jako nový druh Foxem v roce 2000.9 Tento organismus byl později izolován od pacientů s enteritidou. Za rezervoár jsou považováni divocí ptáci – husy, nově byl nalezen u prasat.
Materiál a metodika
Charakteristika vzorků
V období 2005 – 2007 bylo vyšetřeno celkem 49 hejn brojlerových kuřat, pocházejících z 28 konvenčních farem s intenzivním způsobem výkrmu, lokalizovaných v sedmi krajích ČR. Základní parametry vyšetřovaných farem byly specifikovány ve spolupráci s chovateli pomocí dotazníků připravených v souladu s požadavky EU projektu PoultryFlorGut (www.poultryflorgut.org).
Studie byla zaměřena výhradně na zdravá brojlerová kuřata určená pro spotřebitelský trh. Vyšetřovaným materiálem byl obsah caeca, který byl získán z trávicího traktu odebraného na kuchacím okruhu jatečního provozu. Na průkaz Campylobacter spp. bylo vyšetřeno celkem 1083 vzorků a na průkaz Clostridium perfringens celkem 1211 vzorků. Výskyt Helicobacter pullorum byl sledován na vybraných 13 farmách s intenzivním způsobem výkrmu lokalizovaných v 6 krajích ČR, celkem bylo vyšetřeno 130 vzorků.
Kultivace a identifikace
Kultivace Campylobacter spp. byla prováděna dle ČSN EN ISO 10272 (2006) na mCCDA a Karmali agaru (Oxoid, UK), mikroaerobně (Gas Generating Kit, Oxoid, UK) při 42 °C po dobu 44 ± 2 hodiny. Konfirmace byla provedena mikroskopicky ve fázovém kontrastu, barvením dle Grama a standardními biochemickými testy (OXI test, HIPPURATE test, Pliva-Lachema, CZ). Průkaz Clostridium perfringens byl prováděn dle ČSN EN ISO 7937 na TSC agaru (Oxoid, UK), anaerobně (AnaeroGen, Oxoid, UK) při 37 °C po dobu 22 ± 2 hodiny. Suspektní kolonie byly subkultivovány na krevním agaru, dále biochemicky testovány s využitím diagnostické soupravy ANAEROtest23® (Pliva-Lachema, ČR). Helicobacter pullorum byl monitorován kultivačně filtrační technikou, kdy byly vzorky suspendovány v BHI bujonu (Oxoid, UK) suplementovaném koňským sérem a glukózou a následně filtrovány přes acetáto-celulózový filtr (Millipore, USA) a inkubovány mikroaerobně (80 % N2, 10% H2, 10% CO2) při 37 °C po dobu 7 dnů.
Identifikace a typizace a subtypizace izolátů
Izolace směsné genomové DNA byla prováděna pomocí komerčního izolačního kitu DNeasy® Tissue kit (Qiagen, DE). Pro konfirmaci rodu Campylobacter a identifikaci C. jejuni a C. coli byla použita multiplexní polymerázová řetězová reakce (mPCR)10 v oblasti genů 16SrRNA, mapA a ceuE. Detekce dalších dvou termofilních druhů C. lari a C. upsaliensis byla provedena s využitím polymorfismu délky restrikčních fragmentů (PCR/RFLP),11 kdy byl amplikon variabilní oblasti genu 23S rRNA štěpen pomocí restrikčních endonukleáz AluI a Tsp509I. Pro stanovení genetické variability jednotlivých izolátů C. jejuni byla provedena makrorestikční analýza DNA celého chromozomu pomocí pulsní gelové elektroforézy (PFGE)12 po štěpení restrikčním enzymem SmaI. U izolátů C. perfringens byla metodou mPCR13 stanovena přítomnost genů cpa, cpb, cpe a cpb2 odpovídajících za produkci toxinů α, β, enterotoxin a β2 vyskytujících se u toxinotypu A a toxinotypu C. Přímou identifikaci a současné vzájemné rozlišení Helicobacter pullorum od úzce příbuzného druhu Helicobacter canadensis umožnilo využití metody PCR/RFLP,9 kdy byl amplikon variabilní oblasti genu 16SrRNA štěpen pomocí RE ApaLI.
Výsledky a diskuse
V této práci jsou uvedeny výsledky monitoringu výskytu tří vybraných patogenů Campylobacter spp., Clostridium perfringens a Helicobacter pullorum v trávicím traktu brojlerových kuřat chovaných na 28 konvenčních farmách s intenzivním způsobem výkrmu.
Vyhodnocením údajů získaných z jednotlivých farem bylo zjištěno, že na všech 28 farmách byla chována kuřata brojlerových linií Cobb 500 a Ross 308, s větším zastoupením linie Cobb 500, počet chovaných zvířat se pohyboval v rozmezí od 29 000 do 275 000 kusů, průměrný počet výkrmových cyklů ročně byl 6,98 s průměrnou délkou výkrmu 36,64 dnů. Průměrná konverze krmiva byla 1,77 kg komerční krmné směsi a průměrný denní přírůstek dosahoval 0,06 kg. Výkrm brojlerů byl ve všech případech realizován systémem all in – all out, výkrmové haly byly vybaveny umělým osvětlením, tepelnými zářiči a tunelovým větráním. Brojlerová kuřata byla medikována pouze preventivně (vakcinace proti virovým onemocněním drůbeže zejména infekční burzitidě) s opakovaným podáním vitamínů a antikokcidik. Přesné údaje týkající se každé jednotlivé farmy jsou uvedeny v tab. 1.
tab. 1
Campylobacter spp.
V rámci této studie byla na farmách drůbeže v České republice zjištěna prevalence Campylobacter spp. v míře 92,86 %; na jednotlivých farmách v rozmezí od 22,50 % do 100 %. Maximální záchyt byl zjištěn na 12 farmách, z toho na dvou farmách byl zaznamenán opakovaně u následujících výkrmových hejn ve stejných halách. Pouze dvě farmy byly opakovaně potvrzeny jako negativní. V jednotlivých krajích ČR se prevalence pohybovala v rozmezí od 64,28 % do 100 %, avšak počet vyšetřených farem v jednotlivých krajích byl rozdílný, takže ze stávajících dílčích výsledků nelze usuzovat na vyšší či nižší výskyt termofilních Campylobacter v jednotlivých oblastech. Průměrná hladina výskytu patogena v caecu byla stanovena Log 8,28 cfu/g. Podobně německá studie2 udává frekvenci výskytu Campylobacter spp. v chovech brojlerových kuřat v rozmezí 0,2 – 92 %. Podle údajů publikovaných v souhrnné zprávě EFSA (2007)1 je dlouhodobě pozorován nejnižší pozitivní záchyt v hejnech drůbeže v severských evropských zemích: v Norsku (3,7 %), Finsku (5,9 %) a v Litvě (0,3 %). Naopak nejvyšší výskyt udává Itálie – Veneto (83,2 %) a Francie (81,7 %). Studie z USA6 uvádějí promořenost intenzivních farem brojlerů v rozmezí 20 – 90 %, což představuje podobnou situaci jako v evropských zemích.
Z hlediska druhové variability byl potvrzen výskyt C. jejuni a C. coli; další termofilní zástupci rodu Campylobacter nebyli zjištěni. Celkem 60,94 % pozitivních kuřat bylo kolonizováno druhem C. jejuni a 8,22 % druhem C. coli; u 9,05 % kuřat byly v caecu zjištěny oba termofilní druhy. Vztaženo na jednotlivé farmy byl C. jejuni zjištěn na 24 farmách s frekvencí výskytu v rozmezí 10 - 100%, C. coli byl nalezen na 15 farmách v rozmezí výskytu 1 – 90 %. Oba druhy buď kolonizovaly celé hejno samostatně, nebo jako směs (současný výskyt C. jejuni i C. coli v caecu), případě byl v části hejna identifikován C. jejuni a v druhé části C. coli. Celkově byly zjištěny všechny kombinace výskytu obou druhů: na 11 farmách byl přítomen pouze C. jejuni, na 1 farmě pouze C. coli a samotný směsný výskyt byl nalezen na 2 farmách. Získané výsledky jsou v souladu s údaji z ostatních evropských zemí,1 ve kterých byl potvrzen výskyt C. jejuni 52 – 90 % a výskyt C. coli 6 – 42 %. Směsný výskyt C. jejuni a C. coli 3,5 % u brojlerů chovaných na konvenčních farmách a 4,5 % u brojlerů chovaných na ekologických farmách uvádí také dánská studie.14
Hodnocení sezónnosti (variabilita výskytu Campylobacter spp. v jednotlivých ročních obdobích) bylo v rámci naší práce, provedeno na základě opakovaných odběrů na zvolených farmách. Bylo prokázáno, že výskyt Campylobacter spp. ve slepém střevě kuřat chovaných na identických farmách v průběhu roku mírně kolísá, nižší prevalence byla prokázána v chladném období roku (říjen – únor). Průkazné kolísání výskytu Campylobacter spp. v jednotlivých ročních obdobích udávají studie z Norska, Dánska a Holandska,15,16 které potvrzují statisticky významně vyšší záchyt v teplejších ročních měsících.
Na základě subtypizace pomocí pulsní gelové elektroforézy (PFGE) bylo nalezeno v 319 vzorcích pocházejících z 19 různých hejn 22 PFGE SmaI subtypů. PFGE profily ze vzorků z jednoho hejna byly většinou identické. Ve třech hejnech byly genotypy blízce příbuzné, jelikož PFGE profily se lišily pouze v jednom až třech fragmentech. Brojleři ve čtyřech hejnech byli infikováni 2, 3 – 4 klony, které měly zcela odlišné genotypy a byly zjevně nepříbuzné. Ve dvou a třech odběrech z jednotlivých hejn získaných na čtyřech farmách v rozmezí jednoho až pěti měsíců byly nalezeny kmeny s nepříbuznými genotypy, což svědčí o různých zdrojích infekce v následujících hejnech na jedné farmě.
Clostridium perfringens
Stanovení výskytu C. perfringens lze shrnout takto: z testovaných 28 farem bylo pouze šest farem negativních na přítomnost C. perfrignens, což odpovídá prevalenci 78,57 %. Výskyt kolísal na jednotlivých farmách od 0 do 62 %. Italská studie,17 uvádí prevalenci C. perfringens na farmách s intenzivním výkrmem kuřat 91,3 %. Údaje výskytu patogena jsou sledovány v omezené míře zejména s ohledem na ubikvitární zastoupení klostridií ve střevním traktu. Deset farem bylo vyšetřeno opakovaně v obou sledovaných letech, lze tedy pozorovat určité kolísání výskytu patogena na farmách. Zatímco u některých farem bylo zjištěno nízké procento záchytu (3 – 5 %) a opakovalo se u dvou a více odběrů, u jiných farem bylo nalezeno kolísání až 50 %. Zdůvodněním může být výkrm odlišných brojlerových linií, ovšem literární údaje o této hypotéze nebyly nalezeny.
Vzhledem k mechanismu patogenity se jeví jako důležité sledování koncentrací patogena s určením toxinotypu. Hladina Clostridium spp. byla zjišťována zhruba u 11 % všech odebraných vzorků a pohybovala se v rozpětí 2,77 – 5,51 Log cfu/g, s průměrem 4,42 Log cfu/g střevního obsahu. Získané výsledky jsou srovnatelné i s dalšími autory,17,18 kteří udávají průměrnou hladinu koncentrace 4,56 Log cfu/g u kuřat z farem s intenzivním způsobem výkrmu. Typová příslušnost všech kmenů (n=176) za celé sledované okolí je uniformní. Izoláty byly pomocí molekulárně biologických metod přiřazeny k typu A, u části kmenů (n=12) byla potvrzena přítomnost genu cpb2 (6,8 %), ani jeden kmen neměl gen cpe, odpovídající za produkci enterotoxinu. U drůbeže je C. perfrignens typu A dominantní. V Evropě jsou údaje limitovány studiemi ze Švédska, Dánska, Finska, Belgie a Itálie.17,19-21 Závěry těchto studií se shodují v určení typu A C. perfringens, přičemž ve dvou případech19,21 byl prokázán také nález genu cpb2; enterotoxinový gen byl nalezen pouze sporadicky. Funkci β2 toxinu v patogenenzi nekrotické enteritidy drůbeže se pokoušeli objasnit Crespo et al.,22 kteří došli k závěru, že se tento toxin na vzniku nekrotické enteritidy nepodílí (na rozdíl od známého patogenního působení u koní, prasat aj. zvířat). Toto tvrzení uvádí také další studie,23 která potvrdila nález genu cpb2 u 75 % zdravých vyšetřovaných kuřat a která rovněž prokázala existenci více genetických variant genu cpb2.
Helicobacter pullorum
O výskytu nového potencionálního intestinálního patogena H. pullorum u drůbeže je známo pouze velmi omezené množství informací. Švýcarská studie24 uvádí pozitivní záchyt u 4 % vyšetřených brojlerů, zatímco monitoring provedený v Anglii25 uvádí pozitivní záchyt u 60 % brojlerů. V rámci naší studie byl výskyt Helicobacter pullorum sledován v trávicím traktu 130 brojlerových kuřat pocházejících z 13 konvenčních farem ČR. Kultivační a molekulárně biologická analýza vzorků potvrdila 53,8 % vyšetřených farem pozitivních na přítomnost tohoto patogena. Šest farem bylo opakovaně negativní. Prevalence se na jednotlivých farmách pohybovala v rozmezí 80 – 100 %. Ve studii provedené v Itálii byla metodou PCR detekována přítomnost H. pullorum na všech sedmi testovaných farmách, zatímco kultivační technikou byla prokázána pozitivita pouze u dvou farem. Také na základě našich zjištění lze konstatovat, že průkaz H. pullorum pomocí standardních kultivačních technik je vzhledem k vysokým nárokům patogena problematický a je vhodné ho kombinovat nebo nahradit detekční metodou mPCR za použití směsné DNA izolované přímo ze vzorku obsahu céka. Podrobnější analýza výskytu vzhledem k jednotlivým částem střevního traktu (duodenum, cékum, jejunum) prokázala nejvyšší záchyt H. pullorum ze slepého střeva. Úzce příbuzný Helicobacter canadensis nebyl detekován.
Závěr
Výsledky této práce potvrzují vysokou prevalenci epidemiologicky významných intestinálních patogenů Campylobacter jejuni a Clostridium perfringens u jatečných brojlerových kuřat v České republice. Zároveň byl potvrzen výskyt nově specifikovaného potenciálního patogena Helicobacter pullorum. Stanovení frekvence výskytu a podrobnější charakterizace patogenů vyskytujících se v trávicím traktu brojlerových kuřat představují důležité poznatky pro nastavení opatření vedoucích k eliminaci těchto mikrobiologických nebezpečí primárně na úrovni farem a dále v jatečných a zpracovatelských provozech a výsledně ve finálních živočišných surovinách a potravinách. Pro určení dalších rizik, která mohou zjištěné patogeny představovat pro humánního konzumenta je nezbytné provést další studie zahrnující především srovnávání genetické příbuznosti izolátů získaných z chovů hospodářských zvířat a od humánních pacientů a v neposlední míře také posouzení citlivosti získaných izolátů k antibiotikům.
Práce byla řešena za finanční podpory Výzkumného záměru Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin MSM 621571240 a projektu 6. rámcového programu EU POULTRYFLORGUT FOOD-CT-200X-007076.
Literatura:
1. The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents, Antimicrobial Resistance and Foodborne Outbreaks in the European Union in 2006; EFSA J 130:1-310.
2. Atanassova, V., Ring, C. Prevalence of Campylobacter spp. in poultry and poultry meat in Germany. Int J Food Microbiol 1999;51:187-190.
3. Hald, B., Skovgård, H., Bang, D., et al. Flies and Campylobacter infection of broiler flocks. Emerg Infect Dis 2004;10:1490-1492.
4. Stern, N. J., Reiersen, J., Lowman, R., et al. Occurrence of Campylobacter spp. in cecal contents among commercial broilers in Iceland. Foodborne Pathog Dis 2005;2:82-89.
5. Padungton, P., Kaneene, J. B. Campylobacter spp. in human, chickens, pigs and their antimicrobial resistance. J Vet Med Sci 2003;65:161-170.
6. Luangtongkum, T., Morishita, T. Y., Ison, A. J., Huang, S., Mcdermott, P. F., Zhang, Q. Effect of conventional and organic production practices on the prevalence and antimicrobial resistance of Campylobacter spp. in poultry. Appl Environ Microbiol 2006;72:3600-3607.
7. Newell, D. G., Davison, H. C. Campylobacter: Control and prevention. In: Torrence, M. E. and Isaacson, R. E. Microbial food safety in animal agriculture: current topics. USA; Iowa State Press Ames, 2003:211-220.
8. Van Immerseel, F., De Buck, J., Pasmans, F., Huyghebaert, G., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Clostridium perfringens in poultry: an emerging threat for animal and public health. Avian Pathol 2004;33:537-549.
9. Fox, J. G., Chien, Ch. Ch., Dewhirst, F. E. Helicobacter canadensis sp. nov. isolated from humans with diarrhoea as an example of an emerging pathogen. J Clin Microbiol 2000;38:2546-2549.
10. Denis, M., Soumet, C., Rivoal, K. et al. Development of a m-PCR assay for simultaneous identification of Campylobacter jejuni and C. coli. Lett Appl Microbiol 1999;29: 406-410.
11. Fermér, C., Engvall, E. O. Specific PCR identification and differentiation of the thermophilic campylobacters, Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari, and C. upsaliensis. J Clin Microbiol 1999;37:3370-3373.
12. Hänninen, M. L., Hakkinen, M., Rautelin, H.. Stability of related human and chicken Campylobacter jejuni genotypes after passage through chick intestine studied by pulse-field gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol 1999;65:2272-2275.
13. Baums, Ch. G., Schotte, U., Amtsberg, G., Goethe, R. Diagnostic multiplex PCR for toxin genotyping of Clostridium perfringens isolates. Vet Microbiol 2004;100:11-16.
14. Heuer, O. E., Pedersen, K., Andersen, J. S., Madsen, M. Prevalence and antimicrobial susceptibility of thermophilic Campylobacter in organic and conventional broiler flocks. Lett Appl Microbiol 2001;33:269-274.
15. Hofshagen, M., Kruse, H. Reduction in flock prevalence of Campylobacter spp. in broilers in Norway after implementation of an action plan. J Food Prot 2005;68: 2220-2223.
16. Bouwknegt, M., Van De Giessen, A. W., Dam-Deisz, W. D., Havelaar, A. H., Nagelkerke, N. J., Henken, A. M. Risk factors for the presence of Campylobacter spp. in Dutch broiler flocks. Prev Vet Med 2004;62:35-49.
17. Manfreda, G., De Cesare, A. Report on the evaluation of the incidence of Helicobacter pullorum and Clostridium perfringens as emerging and re-emerging food-borne pathogens in broilers (online). PoultryFlorGut 2006; (www.poultryflorgut.org)
18. Dahiya, J. P., Wilkie, D. C., Van Kessel, A. G., Drew, M. D. Potential strategies for controlling necrotic enteritis in broiler chickens in post-antibiotic era. Anim Feed Sci Technol 2006;129:60-88.
19. Engström, B. E., Fermér, C., Lindberg, A., Saarinen, E., Båverud, V., Gunnarsson, A. Molecular typing of isolates of Clostridium perfringens from healthy and diseased poultry. Vet Microbiol 2003;94:225-235.
20. Nauerby, B., Pedersen, K., Madsen, M. Analysis by pulsed-field gel electrophoresis of the genetic diversity among Clostridium perfringens isolates from chickens. Vet Microbiol 2003;94:257-266.
21. Gholamiandekhordi, A. R., Ducatelle, R., Heyndrickx, M., Haesebrouck, F., Van Immerseel, F. Molecular and phenotypical characterization of Clostridium perfringens isolates from poultry flocks with different disease status. Vet Microbiol 2006; 113:143-152.
22. Crespo, R., Fisher, D. J., Shivaprasad, H. L., Fernandéz-Miyakawa, E., Uzal, F. A. Toxinotypes of Clostridium perfringens isolated from sick and healthy avian species. J Vet Diagn Invest 2007;19:329-333.
23. Chalmers, G., Martin, S. W., Hunter, D. B, Prescott, J.F., Weber, L. J., Boerlin, P. Genetic diversity of Clostridium perfringens isolated from healthy broiler chickens at a commercial farm. Vet Microbiol 2008;5:116-127.
24. Burnens, A. P., Stanley, J., Nicolet, J. Possible association of Helicobacter pullorum with lesions of vibrionic hepatitis in poultry. In: Newell, D. G., Ketley, J. M., Feldman, R. A. Campylobacters, Helicobacters and Related Organisms. New York; Plenum press, 1996:291-294.
25. Atabay, H. I., Corry, J. E. The prevalence of campylobacters and arcobacters in broiler chickens. J Appl Microbiol 1997;5:619-626.
Adresa autora:
Ing. Gabriela Bořilová, Ph.D.
VFU FVHE
Ústav hygieny a technologie masa
Palackého 1 – 3
612 42 Brno
e-mail: gborilova@vfu.cz
