M. MACHATKOVÁ
Výzkumný śtav veterinárního lékařství, Brno
Veterinářství 2006;56:299-301.
SOUHRN
Vývojové trendy v produkci geneticky cenných embryí skotu superovulací a metodou in vitro. Článek pojednává o nedávném vývoji i současném stavu v oblasti produkce a přenosů raných embryí skotu, a to jak v zahraničí tak i v České republice. Jsou popsány metody používané pro produkci geneticky cenných embryí, jejich přednosti a současné možnosti včetně aplikace těchto metod ve šlechtitelských programech.
SUMMARY
Developmental trends in the production of genetically valuable cattle embryos by superovulation and in vitro method.
The article deals with recent development and current state in the field of production and transfer of early bovine embryos, both abroad and in the Czech Republic. The methods used for the production of genetically valuable embryos, their advantages and contemporary possibilities including application of these methods in breeding programs have been described.
Úvod
Hlavním záměrem šlechtitelských programů v chovu skotu je rychlé dosažení specifických chovatelských cílů intenzivním využitím pohlavních buněk geneticky cenných zvířat. Jednou z efektivních metod vhodných pro tyto účely jsou metody produkce a přenosu raných embryí. V současné době jsou embrya požadovaného původu získávána pomocí MOET programu (most ovulation and embryo transfer) nebo v in vitro systému (IVP – in vitro production).1,2
Vyvolání vícečetné ovulace hormonálním ošetřením donorky, její inseminace a výplach i přenos získaných embryí do synchronizovaných příjemkyní dnes patří k běžně používaným metodám šlechtění. Rozsah aktivit v této oblasti dokumentuje skutečnost, že podle údajů Evropské asociace pro embryo transfer bylo v roce 2004 v Evropě vypláchnuto celkem 17 458 superovulovaných donorek a získáno 101 989 přenosuschopných embryí (21th European Embryo Transfer Association Meeting, Keszthely, 2005).3
Průměrný počet přenosuschopných embryí vypláchnutých na donorku se v období posledních pěti let zvýšil o 0,5 embrya a dosáhl hodnoty 5,8. Více než polovina ze 87 551 přenesených embryí (55,1 %) byla před přenosem konzervována. V České republice bylo v průběhu roku 2004 vypláchnuto 1184 superovulovaných donorek a získáno 6400 přenosuschopných embryí. V našich podmínkách bylo získáno průměrně 5,4 přenosuschopných embryí na donorku, z 6344 přenesených embryí bylo 42,2 % před přenosem konzervováno.
Srovnáme-li základní kvantitativní ukazatele týkajících se produkce a přenosu embryí získaných hormonální stimulací v Evropě za posledních deset let, dojdeme k závěru, že metoda superovulace a přenosu získaných embryí si udržuje v procesu šlechtění svoje stabilní místo jak v zahraničí, s mírně se zvyšujícím trendem jejího využití v chovatelsky vyspělých zemích , jako jsou Holandsko, Francie a Německo, tak i v České republice, kde se za poslední desetiletí počet vypláchnutých donorek i vyprodukovaných přenosuschopných embryí zvýšil o více než 40 %.
Hlavním předmětem zájmu specialistů, kteří dále rozvíjejí tuto biotechnologickou metodu je zdokonalení a standardizace superovulačních postupů především cestou optimalizace přípravy donorek na základě současných znalostí fyziologie ovariálního cyklu a jeho vlivu na průběh superovulace. Značná pozornost je věnována i definování podmínek přípravy recipientek a jejich zdraví jako významných faktorů ovlivňujícího úspěšnost celého procesu.
Metoda jednorázové nebo opakované hormonální stimulace však nemusí být u všech donorek spolehlivá, u některých nelze vyvolat odpovídající odezvu na hormonální preparáty, u jiných dochází po opakované stimulaci ke snížení odezvy, zhoršení kvality získaných embryí nebo prodloužení doby potřebné pro začlenění donorky zpět do reprodukce. Přestože superovulace představuje stále hlavní zdroj přenosuschopných embryí, do popředí zájmu se dostává především v chovatelsky vyspělých zemích, kvalitativně vyšší, po metodické i technické stránce náročnější metoda, jakou je produkce embryí v podmínkách in vitro. Svoji úlohu hraje i skutečnost, že ve srovnání se superovulací, umožňuje fertilizace oocytů a příprava embryí vitro (IVF) významně omezit používání hormonálních preparátů.
O možnosti aplikace metody produkce embryí in vitro ve šlechtění skotu svědčí relativně rychlý vzestup počtu embryí získaných tímto způsobem, ke kterému došlo v Evropě v průběhu let 1997 až 2000 i stabilizace počtu těchto embryí produkovaných v následujícím období. V posledních letech bylo v Evropě připraveno z pohlavních buněk geneticky cenných rodičů ročně průměrně 14 555 embryí a 9 645 z nich bylo přeneseno do synchronizovaných příjemkyní, což představuje asi 8 – 10 % z celkového počtu provedených přenosů. Přední místo zaujímají v tomto směru Holandsko, Německo, a Itálie, kde podíl přenosů embryí produkovaných in vitro tvoří 12 – 36 % z celkového počtu provedených embryotransferů.
V řadě laboratoří jsou nyní k přípravě těchto embryí používány relativně opakovatelné postupy, které umožňují dosáhnout 90 % podílu zralých oocytů, více než 60 % podílu normálně oplozených oocytů a 30% podílu experimentálních embryí z počtu inseminovaných oocytů. V průběhu vývoje metody oplození in vitro bylo nutno studovat vliv mnoha faktorů, u kterých se předpokládalo, že mohou ovlivnit proces zrání, oplození i časného embryonálního vývoje. Bylo potvrzeno, že pro vývoj těchto embryí je rozhodující především období kompaktace morul a jejich diferenciace ve stadiu časné blastocysty, které jsou determinovány podmínkami zrání a prvního buněčného dělení. Velká pozornost je proto stále věnována vývoji účinnějších kultivačních medií a vhodných aditiv umožňujících překonat vývojový blok a stimulujících diferenciaci raných embryí. Hlavním cílem vývoje metod produkce embryí in vitro v ČR je, podobně jako u laboratoří stejného zaměření v zahraničí, další metodický pokrok směřující k vyšší produkci embryí požadovaného původu využitelných v oblasti šlechtění.
Diskuse
Jestliže současné metodické postupy umožňují získat dostatečný podíl embryí pro experimentální účely, potom výsledky dosažené při přípravě embryí od vybraných rodičovských párů jsou velmi variabilní. Existují významné rozdíly u individuálních donorek v počtu izolovaných oocytů a jejich vývojové kompetenci stejně jako u býků ve schopnosti jejich spermií oplodnit oocyty v podmínkách in vitro. Rozhodující význam pro zisk embryí má především počet izolovaných, morfologicky kvalitních, oocytů. Pokud jsou tyto oocyty oplozeny spermiemi v systému IVF prověřených býků s odpovídající oplozovací schopností a je použita vhodná rodičovská kombinace je podíl embryí vyvíjejících se z fertilizovaných oocytů relativně vysoký (25 – 35 %).
Proto je třeba řešit řadu dalších otázek spojených se zvýšením vývojové kompetence oocytů, optimalizací podmínek kapacitace spermií a oplození u individuálních býků i interakcí gamet obou rodičů. Tyto faktory jsou velmi významné pro kvalitu získaných embryí, jejich zmrazitelnost a vývoj embryí po přenosu do synchronizovaných příjemkyní.
Současné znalosti fyziologie pohlavních buněk a metodická úroveň laboratoří produkujících embrya v podmínkách in vitro umožňují využít oocyty získané od donorek jak v období rané pohlavní zralosti a v průběhu jejich života tak i post mortem.4,5 Počet oocytů získaných z ovárií donorky post mortem je vysoce variabilní (5 – 50); průměrně je izolováno 25 oocytů, ze kterých je získáno pět přenosuschopných embryí.
Poněvadž produkce embryí z oocytů získaných z ovárií krav post mortem je limitována a je určena pouze pro vyřazené, geneticky cenné donorky, pro získání oocytů od reprodukčně zdravých donorek byla vyvinuta metoda transvaginální aspirace oocytů (OPU – ovum pick up) za pomocí sonografie. Při transvaginálním odběru oocytů z ovárií živých donorek je možno v současné době dosáhnout asi 60 % úspěšnosti, to znamená při punkci 10 – 12 folikulů aspirovat asi šest až sedm oocytů na jednu donorku. Po fertilizaci těchto oocytů je průměrně získáno 1,5 embrya.
Vedle možnosti využít tuto metodu v době plného reprodukčního zdraví donorky je uvedený způsob získávání oocytů vhodný pro cyklující, reprodukčně problémové krávy, které nezabřezávají po inseminaci, neodpovídají na hormonální ošetření nebo neprodukují přenosuschopná embrya. Při správné aplikaci metody a opakované punkci folikulů dochází k aktivaci folikulárního vývoje, poněvadž každá z provedených aspirací oocytů vyvolává na ováriích přirozené folikulární vlny bez toho, že by negativně ovlivnila další reprodukční schopnost donorky. Účinnost metody je závislá na individualitě donorky, technickém vybavení týmu, použité metodě punkce a aspiračním schematu. Metoda transvaginální aspirace oocytů, jejich fertilizace a produkce přenosuschopných embryí má ve srovnání se standardními metodami superovulace a výplachu donorek některé přednosti, mezi které patří:
– vyloučení aplikace hormonů, není nutná hormonální stimulace donorek
– možnost opakované aspirace oocytů, 1 – 2x týdně, po dobu tří až šesti měsíců
– možnost aspirace oocytů od donorek v období rané puberty nebo časné gravidity
– produkce embryí od neplodných krav nebo donorek s neúspěšnou superovulací
– rozšíření kombinací rodičovských párů oplozením oocytů spermiemi více býků
Metoda OPU/IVF může být ve šlechtitelských programech kombinována s metodou superovulace podle následujícího schématu:
– výběr a superovulace donorek
– výplach a konzervace embryí získaných po superovulaci
– inseminace donorek, přenos konzervovaných embryí do synchronizovaných příjemkyní
– opakovaná aspirace oocytů od donorek v průběhu prvního trimestru jejich gravidity (OPU/IVF)
– zpětné zařazení donorek do MOET programu
– kombinace superovulace a OPU/IVF podle individuální odezvy donorek
– využití ovárií donorek post mortem po jejich vyřazení
Závěr
V současné době jsou studovány možnosti jak maximalizovat počet použitelných folikulů, na ovariích, zvyšovat účinnost aspirace, kvalitu oocytů a jejich vývojový potenciál. Pokud se podaří tyto otázky úspěšně řešit, může v budoucnu metoda OPU/IVF postupně nahradit metodu superovulace. Svědčí o tom pozornost, která je této metodě věnována v Německu, Itálii, Francii a především v Holandsku, kde jsou její výsledky prakticky ověřovány v rámci šlechtitelských programů. Z celkového počtu embryí produkovaných in vitro a přenesených každoročně v Evropě je téměř 70 % připraveno uvedeným způsobem. Předpokládá se, že metoda OPU-IVF umožní v budoucnu zvýšit podíl potomstva od geneticky cenných rodičů a usnadní tak získání potřebného genetického materiálu i pro klonování embryí a genovou manipulaci.
Příspěvek byl zpracován za podpory grantu MZE 0002716201 MZ ČR.
Literatura:
1. M. Machatková, J. Horáková, K. Hanzalová, Z. Peslarová Vývoj biotechnických metod a využití produkce embryí skotu in vitro. In: Seminář Dvacet let přenosu embryí skotu v České republice. Litomyšl, 13. 5. 2004, Sborník VÚCHS Rapotín, 2004:30-41.
2. Machatková, M.,. Hanzalová, K., Horáková, J. Produkce embryí hospodářských zvířat in vitro a jejich využití pro embryotransfer. Náš chov 2005;5:16-18.
3. In 21th European Embryo Transfer Association Scientific Meeting, Keszthely, 9th-10th September 2005, Proceedings, 201 s.
4. Říha J., Machatková M., Petelíková J., Jakubec V., Pytloun J., Šereda L., Pavlok A. In Biotechnologie v chovu hospodářských zvířat. Rapotín, 1999:166 s.
5. Machatková M., Horáková J., Hanzalová K., Rečková, Z. The efficiency of in vitro embryo production from high performance parents in cattle. In: 21th European Embryo Transfer Association Scientific Meeting, Keszthely, 9th-10th September 2005, Proceedings, 168s.
Adresa autora:
Ing. Marie Machatková, CSc.
Oddělení genetiky a reprodukce
Výzkumný ústav veterinárního lékařství
Hudcova 70
621 32 Brno
machatkova@vri.cz
