Cryptosporidium muris – původce žaludeční kryptosporidiózy hlodavců

L. HŮRKOVÁ, D. MODRÝ
Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
2003;53:230-232.

SOUHRN
Hůrková L., Modrý D. Cryptosporidium muris – původce žaludeční kryptosporidiózy hlodavců. Veterinářství 2003;53:230-232.
Cryptosporidium muris je typovým druhem rodu Cryptosporidium. Přestože bylo objeveno téměř před sto lety, patří na rozdíl od C. parvum mezi parazity málo známé. Cílem tohoto článku je stručně shrnout dosavadní poznatky o C. muris, upozornit na časté nálezy u hlodavců a zároveň prezentovat nálezy C. muris u nových hostitelů čeledi veverkovitých a morčatovitých.

SUMMARY
Hůrková L., Modrý D. Gastric form of cryptosporidiosis in rodents caused by Cryptosporidium muris. Veterinářství 2003;53:230-232.
Cryptosporidium muris is a type species of the genus Cryptosporidium. This parasite was discovered almost one hunder years ago, but is still little known. Rodents are typical hosts. The aim of this paper is to summarize the knowledge about C. muris and inform about the C. muris infections in rodents. This is the first report of C. muris in members of the family Sciuridae and in Patagonian cavies Dolichotis patagonum.

Kokcidie rodu Cryptosporidium jsou celosvětově rozšíření intracelulární parazité obratlovců, známí již od počátku 20. století. Moderní výzkum začal až v letech osmdesátých, kdy novou vlnu zájmu vyvolalo zjištění, že kryptosporidie mohou být jednou z vážných příčin ekonomických ztrát v chovech zvířat i původci epidemií u lidí. Jedním z důkazů přetrvávající pozornosti jsou pak recentní popisy několika nových druhů (C. andersoni, 2000; C. gali, 2001; C. canis, 2001; C. molnari, 2002, C. hominis, 2002). Paradoxem zůstává, že první a tudíž typový druh, C. muris, patří stále mezi druhy jen málo známé a prostudované. Vzhledem k tomu, že se v poslední době množí případy diagnostiky žaludečních kryptosporidióz v chovech různých druhů hlodavců, považujeme za užitečné shrnout základní poznatky o původci tohoto onemocnění.

Rod Cryptosporidium - zařazení, lokalizace, druhy, hostitelé
V rámci tradičních protozoologických klasifikacích jsou tito prvoci spolu s „klasickými“ kokcidiemi řazeni do třídy Coccidea, kde tvoří samostatnou čeleď Cryptosporidiidae. Současné fylogenetické práce založené na analýze vybraných částí genomu však naznačují blízkou příbuznost kryptosporidií s jinými prvoky kmene Apicomplexa – s gregarinami (třída Gregarinea).¹ V rámci rodu Cryptosporidium existují dvě vývojové linie, lišící se řadou znaků, z nichž nejtypičtějším je lokalizace endogenních stadií. Endogenní vývoj kryptosporidií probíhá v buňkách gastrointestinálního traktu. U všech vyšších obratlovců nalézáme druhy osidlující střevní epitel i druhy s vývojem lokalizovaným ve sliznici žaludku. Postiženy však mohou být i další orgánové soustavy, zejména u ptáků (C. baileyi), kde může být vývoj lokalizován kromě trávicí soustavy také v plicích, vzdušných vacích, Fabriciově burze nebo v ledvinách. Mezi „střevní“ druhy patří kromě C. parvum ještě 8 validních druhů, sliznici žaludku pak osidluje dalších 5 druhů. V současné klasifikaci kryptosporidií se stále více uplatňují metody molekulární taxonomie a je pravděpodobné, že počet popsaných druhů rychle poroste. Otázkou ovšem je, jaký praktický význam má pojmenování nových druhů čistě na základě odlišností detekovatelných molekulárními technikami. Všechny výše uvedené druhy kryptosporidií mohou způsobovat různě závažná klinická onemocnění, ať už u typických, či atypických hostitelů. Významnou úlohu v míře postižení hraje imunitní systém hostitele. U člověka byly dosud popsány infekce druhy C. andersoni, C. baileyi, C. canis, C. felis, C. meleagridis, C. muris, C. parvum a C. hominis. S výjimkou infekcí C. parvum se však jednalo o nálezy u pacientů s alterovaným imunitním systémem.

Cryptosporidium muris – historie
Cryptosporidium muris bylo objeveno americkým parazitologem Ernestem E. Tyzzerem v roce 1907 v žaludečních žlázkách laboratorních myší, tentýž autor v roce 1910 také popsal jeho životní cyklus.² C. parvum pak bylo popsáno až o další dva roky později, rovněž Tyzzerem. Počátkem 80. let minulého století navrhl významný americký protozoolog Norman D. Levine sloučení obou druhů, přestože původní popis jasně ukazoval morfologické i vývojové rozdíly. Krátce na to Upton a Current³ popsali nález C. muris podobných oocyst v trusu skotu z několika států v USA a vyzdvihli odlišnosti mezi C. muris a C. parvum. Jelikož jimi nalezené oocysty byly morfologicky shodné s žaludečními kryptosporidiemi z myší, považovali tyto izoláty za C. muris. V dalším desetiletí bylo rozšířeno spektrum hostitelů C. muris o nové, převážně experimentální hostitele. Přibývaly i záchyty žaludečních kryptosporidií u skotu, ale většina experimentálních hlodavců nebyla k bovinním izolátům vnímavá.^4,5 Teprve velmi nedávno byl na základě morfometrie, spektra hostitelů a molekulární analýzy ribozomální DNA potvrzen samostatný druhový statut žaludečních izolátů z přežvýkavců a druh byl pojmenován C. andersoni.⁴

Hostitelé C. muris
Typickými přirozenými hostiteli C. muris jsou hlodavci z čeledi myšovitých a křečkovitých. Kromě infekcí u hlodavců byla popsána i přirozená infekce damana kapského a velblouda dvouhrbého. Starší práce, které uvádějí jako hostitele C. muris také skot,⁶ se zřejmě týkají C. andersoni. Experimentální infekce rozšířily spektrum hostitelů C. muris o morčata, králíky, kočky a psy. Popsán je i nález žaludeční kryptosporidiózy u imunosuprimovaných makaků.⁷ V poslední době byly také zaznamenány nálezy oocyst C. muris u člověka. V jednom případě se jednalo o popis C. muris-podobných oocyst u dvou indonéských dívek a další dva nálezy se týkaly infekce C. muris u HIV-pozitivních pacientů z Keni a Thajska.

C. muris – vývoj, morfologie a klinické příznaky
Endogenní vývoj C. muris probíhá v buňkách žaludečních žlázek. Vývojová stadia se nacházejí intracelulárně, uložená extracytoplazmaticky v parazitoforní vakuole. Ke sporulaci oocyst dochází in situ. Plně vysporulované oválné oocysty měřící okolo 7,5 × 5,5 µm jsou následně vylučovány trusem hostitele. Uvnitř oocysty se nacházejí čtyři protáhlí sporozoiti a výrazné reziduální tělísko. Stěna oocysty je tenká a hladká, na jednom z pólů se suturou sloužící k excystaci sporozoitů. K infekci hostitele dochází po perorálním příjmu oocyst. Ani u lidí ani u zvířat nebyly dosud zaznamenány výraznější klinické příznaky doprovázející infekci C. muris. Žaludeční kryptosporidiózu skotu mohou provázet nespecifické příznaky, jako je pokles produkce mléka a nižší váhové přírůstky⁸.

Diagnostika infekcí C. muris
Intravitální diagnostika kryptosporidióz je ve veterinární praxi založena především na detekci oocyst v trusu pomocí flotačně koncentračních metod nebo barvením. Pro flotační vyšetření se zdá být nejvýhodnější roztok sacharózy o specifické hmotnosti 1,3 g/ml (Sheatherův roztok). Z velkého množství barvicích technik je možno zmínit metodu dle Miláčka a Vítovce, barvení Giemsovým barvivem nebo Ziehl-Neelsenovu metodu. Oocysty kryptosporidií v roztěrech lze diagnostikovat nepřímou imunofluorescencí s rodově specifickými monoklonálními protilátkami. K druhové identifikaci kryptosporidií je možno využít molekulární techniky, kdy nejčastěji sledovaným bývá gen pro 18S rRNA nebo COWP (Cryptosporidium oocyst wall protein) gen.
Postmortálně mohou být oocysty C. muris detekovány v obsahu trávicí soustavy nebo v žaludečním seškrabu, přičemž opět lze využít výše uvedené metody. C. muris je možno diagnostikovat také v histologických preparátech zhotovených ze žláznaté části žaludku, kdy v lumen žlázek nalézáme různá vývojová stadia. Histologický nález je oproti flotačnímu vyšetření trusu méně senzitivní.

Vlastní práce
V rámci vyšetřování širokého spektra hlodavců jsme v posledních letech C. muris diagnostikovali v chovu laboratorních myší, syrských křečků, ve skupině importovaných burunduků páskovaných (Eutamias sibiricus)⁹ a opakovaně pak ve skupině mar stepních (Dolichotis patagonum) chovaných v ZOO. U tří zkoumaných izolátů jsme experimentálními infekcemi zjistili vnímavost laboratorních myší a několika dalších druhů hlodavců. Jako jednoznačně nevnímaví hostitelé se ukázaly bělozubky (Crocidura suaveolans), jejichž odolnost k experimentální infekci koresponduje s absencí nálezů žaludečních kryptosporidií u hmyzožravců vůbec.
U všech našich izolátů byl histologickým vyšetřením experimentálně infikovaných hlodavců potvrzen endogenní vývoj v buňkách žaludečních žlázek. Morfologie i velikost oocyst u všech tří případů odpovídala druhu C. muris (tabulka 3). Histopatologický nález se lišil v závislosti na druhu hostitele a trvání infekce. U BALB/c myší infikovaných izolátem z burunduka bylo histologické vyšetření provedeno 7., 14., 21., 28., 35. a 42. den po infekci (DPI). Pozitivní byly nálezy 14. a 21. DPI, přičemž žaludeční žlázky byly dilatované a vyplněné množstvím vývojových stadií. Buněčná infiltrace nebyla zaznamenána. Žádná endogenní stadia nebyla nalezena 7., 28., 35. a 42. DPI, navíc po 28. dnu byly žaludeční žlázky atrofované, opět však bez buněčné infiltrace. Tyto nálezy plně nekorelují s nálezy oocyst v trusu, neboť vylučování probíhalo zhruba od 10. do 35. DPI (s vrcholem okolo 23. DPI). Stejným izolátem byly infikovány také bodlinaté myši (Acomys cahirinus), u nichž k vylučování oocyst docházelo 10. až 108. DPI a histologický nález 52. DPI odhalil výraznou dilataci žlázek s poškozením buněk a četnými endogenními stadii v lumen. Z použitých druhů hlodavců byly k infekci C. muris nejvíce vnímavé bodlinaté myši a krysy malé (Mastomas natalensis), které je tak možno využít jako vhodné modelové hostitele ke studiu žaludečních kryptosporidiózy. Doba vylučování oocyst u obou druhů těchto hlodavců přesáhla 9 měsíců. Během této periody, která byla ukončena koncem experimentu, došlo několikrát k přerušení vylučování oocyst. Tento fakt si lze vysvětlit opakovanou přirozenou reinfekcí způsobenou příjmem oocyst z prostředí nádrží či koprofagií (oocysty jsou v čerstvém trusu již vysporulované a tudíž plně infekční). Vylučování oocyst zřejmě ustane až poté, co je imunitní systém schopný zabránit uchycení a vývoji parazita ve tkáni. My jsme odolnost k reinfekci prokázali ve dvou experimentech u CD-1 myší, přičemž negativní vždy bylo jak histologické, tak opakované koprologické vyšetření.
Klinicky zjevné příznaky infekce nebyly patrné ani u importovaných burunduků, mar stepních ani u žádného z experimentálně infikovaných zvířat. Všechna zvířata během infekce jevila zájem o okolí a normálně přijímala vodu i potravu.
V kontrastu k našim výsledkům experimentálních infekcí byla ve velkochovu myší, z kterého pocházel jeden z námi studovaných izolátů, zaznamenána zvýšená morbidita a mortalita zvířat. Rutinní parazitologické vyšetření prokázalo kromě C. muris také roupy rodu Syphacia, tasemnice Hymenolepis nana a kokcidie rodu Eimeria. Zdravotní problémy v tomto chovu byly s vysokou pravděpodobností způsobeny ostatními nalezenými parazity nebo jinými infekčními agens. Podíl C. muris na změnách zdravotního stavu však nelze vyloučit.

Praktický význam a možná opatření v chovech hlodavců
C. muris má nízkou hostitelskou specifitu. V chovech hlodavců je důležité umístit nově příchozí zvířata do karantény. Standardní doba karantény 28 dnů je dostatečná, vzhledem k tomu, že vylučování oocyst začíná běžně do tří týdnů od infekce. Pravidelně by měl být vyšetřován trus nejen zvířat v karanténě, ale i zvířat chovaných. Vyšetřen by měl být vždy co nejvyšší počet zvířat z různých skupin a nádrží, všech věkových kategorií, vyjma neodstavených mláďat. U sajících mláďat se na rozdíl od C. parvum infekce nedají očekávat. Samozřejmostí by mělo být zamezení přístupu volně žijících hlodavců do chovů. Nezbytné je zabránit jak přímému kontaktu, tak i kontaminaci krmiva, podestýlky nebo skladovaného vybavení. Většinu vybavení a pomůcek lze dekontaminovat klasickým způsobem mechanickou a následnou chemickou cestou. O odolnosti oocyst C. muris vůči dezinfekčním prostředkům chybí informace, dá se však předpokládat, že dezinfekční prostředky/postupy účinné proti C. parvum boudou použitelné i v případě C. muris.
Přes veškerou snahu nebylo dosud nalezeno účinné chemoterapeutikum k léčbě kryptosporidióz zvířat a člověka. Rezistence k účinku antikokcidik je zřejmě důsledkem blízké příbuznosti kryptosporidií s gregarinami, respektive jejich nepříbuzností s typickými kokcidiemi. Omezení výskytu kryptosporidií tak spočívá především v preventivních opatřeních a diagnostice.

Literatura:
1. Carreno R. A., Martin D. S., Barta J. R. Cryptopsoridium is more closely releated to the gregarines than to coccidia as shown by phylogenetic analysis of apicomplexan parasites inferred using small-subunit ribosomal RNA gene sequences from varisous hosts. Parasitol Res 1999;85:899-904.
2. Tyzzer E. E. An extracellular coccidium, Cryptosporidium muris (gen. et sp. nov.), of the gastric glands of the common mouse. J Med Res 1910;23:487-509.
3. Upton S. J., Current W. L. The species of Cryptosporidium (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) infecting mammals. J Parasitol 1985;71:625-629.
4. Lindsay D. S., Upton S. J., Owens D. S., Morgan U. M., Mead J. R., Blagburn B. L. Cryptosporidium andersoni n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporiidae) from cattle, Bos taurus. J Eukaryot Microbiol 2000;47:91-95.
5. Koudela B., Modrý D., Vítovec J. Infectivity of Cryptopsoridium muris isolated from cattle. Vet Parasitol 1998;76:181-188.
6. Anderson B. C. Abomasal cryptopsoridiosis in cattle. Vet Pathol 1987;24:235-238.
7. Dubey J. P., Markovits J. E., Killary K. A. Cryptopsoridium muris – like infection in stomach of Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) 2002;39:363-371.
8. Esteban E., Anderson B. C. Cryptosporidium muris: prevalence, persistence, and detrimental effect on milk production in a drylot dairy. J Dairy Sci 1995;78:1068-1072.
9. Hůrková L., Hajdušek O., Modrý D. Natural infection of Siberian chipmunks with Cryptosporidium muris (Apicomplexa: Cryptosporiidae). J Wildlife Dis 2003;39:441-444.

Adresa autora:
MVDr. Lada Hůrková
Ústav parazitologie FVL VFU Brno
Palackého 1-3
612 42 Brno
e-mail: lhurkova@vfu.cz

Kompletní text včetně obrazového materiálu naleznete ve Veterinářství 2003;53:230-232.