L. HŮRKOVÁ, D. MODRÝ
Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
Veterinářství 2004;54:549-557
SOUHRN
Hůrková L., Modrý D. Diferenciální diagnostika oocyst kokcidií rodu Neospora a Hammondia v trusu psů. Veterinářství 2004;54:549-557.
V článku jsou stručně shrnuty informace o kokcidiích z čeledi Sarcocystidae, jejichž vývojová stadia mohou být diagnostikována v trusu psů. Z těchto kokcidií patří mezi nejznámější rody Isospora a Sarcocystis. Klinicky významné jsou především isospory, protože některé druhy způsobují průjmy u štěňat. Naopak téměř neznámými kokcidiemi psovitých šelem jsou Neospora caninum a Hammondia heydorni. Na rozdíl od nepatogenní hammondie je neospora klinicky důležitým patogenem a měla by být zahrnována minimálně do diferenciální diagnostiky neuromuskulárních onemocnění psů. Z hlediska vývojového cyklu a významu pro ostatní hospodářská zvířata je rovněž důležitá správná diagnostika oocyst Neospora caninum a Hammondia heydorni v trusu psů. Proto je zde také blíže popsána diferenciální diagnostika jejich oocyst.
SUMMARY
Hůrková L., Modrý D. Differential diagnostics of coccidia oocysts of genera Neospora and Hammondia in canine feces. Veterinářství 2004;54:549-557.
This is a short review of coccidian parasites from family Sarcocystidae in canids, which can be diagnosed in canine feces. Among these parasites, genera Isospora and Sarcocystis are well known. Members of Isospora are clinically important for causing diarrhea in puppies. On the other hand, Neospora caninum and Hammondia heydorni are practically unknown coccidia. Hammondia heydorni is non-pathogenic, but Neospora caninum is clinically important and, as such, it should be included into the differential diagnosis of neuromuscular diseases in dogs. A correct distinguishing of these coccidia is necessary, because of their different pathogenicity. Thus, the proper differential diagnostics of Neospora and Hammondia in feces of dogs is the aim of this paper.
U psovitých i kočkovitých šelem, psa a kočku nevyjímaje, parazituje celá řada kokcidií čeledi Sarcocystidae. Jmenovitě jsou to rody Isospora*, Sarcocystis, Toxoplasma, Neospora, Hammondia a Besnoitia. Zástupci jednotlivých rodů se liší charakterem vývojových cyklů, patogenitou pro své hostitele a schopností infikovat další živočišné druhy včetně člověka. Správná diferenciace těchto kokcidií je tudíž při parazitologickém vyšetření významným prvkem správně provedené koprologické diagnostiky. Zatímco diagnostika zástupců rodu Sarcocystis a Isospora v trusu psů není příliš komplikovaná, vzájemné rozlišení rodů Neospora a Hammondia je značně problematické. Vzhledem k tomu, že obě tyto kokcidie byly v ČR již diagnostikovány,1,2,3 je přiblížení jejich diferenciální diagnostiky v trusu psů hlavním cílem tohoto článku.
Rod Sarcocystis
Heteroxenní (dvouhostitelské) kokcidie tohoto rodu jsou typickými parazity masožravců, psa nevyjímaje. Vývojový cyklus je obligátně dvouhostitelský a dochází v něm k pravidelnému střídání definitivního hostitele a mezihostitele. Pes figuruje jako definitivní hostitel u řady druhů, které se mohou lišit druhem mezihostitele. Mezi druhy, jejichž definitivním hostitelem je pes (mezihostitel je uveden v závorce), patří: Sarcocystis cruzi (skot), S. tenella (ovce), S. arieticanis (ovce), S. capracanis (koza), S. hircicanis (koza), S. miescheriana (prase), S. bertrami (kůň), S. equicanis (kůň), S. fayeri (kůň). Infikovaní psi vylučují během patentní periody tenkostěnné plně vysporulované oocysty, které se většinou již ve střevě psa rozpadají a v trusu jsou pak nalézány volné eliptické sporocysty o velikosti zhruba 13 – 16 x 7 – 10 μm. Každá sporocysta obsahuje čtyři oválné sporozoity a granulární reziduální tělísko.
Kokcidie rodu Sarcocystis obecně nepůsobí u definitivních hostitelů žádné výrazné klinické příznaky.
Rod Isospora
Od předešlého rodu se liší monoxenním (jednohostitelským) vývojem, který může příležitostně zahrnovat různé obratlovce v roli paratenických hostitelů. Celý vývojový cyklus probíhá ve střevě psa. Trusem jsou vylučovány kulovité nebo široce oválné oocysty vždy v nevysporulovaném stavu. Proces sporulace trvá několik dní. Vysporulované oocysty jsou uniformní, obsahují dvě sporocysty, každou se čtyřmi protáhlými sporozoity. Odlišení oocyst jednotlivých druhů je problematické. Výjimkou je I. canis, jejíž oocysty měří 35 – 42 x 27 – 33 µm a která představuje největší kokcidii psa. Zbylé druhy se velikostmi oocyst překrývají: I. ohionensis 19 – 27 x 18 – 23 µm, I. burrowsi 16 – 22 x 16 – 19 µm, I. neorivolta 17 – 24 x 16 – 22 µm. Za patogenní jsou považovány pouze tyto „menší isospory“ a to především pro štěňata, u nichž je infekce doprovázena průjmy.
Rod Neospora
Je klinicky významnějším ze dvou rodů podčeledi Toxoplasmatinae, se kterými se můžeme u psa setkat. Neospora caninum je parazit, který se v poslední době těší nebývalému zájmu, zejména s ohledem na problémy, které působí v chovech skotu. Přestože o N. caninum bylo na stránkách Veterinářství již referováno,4 shrneme zde opět alespoň nejvýznamnější fakta a klinické aspekty.
Pes figuruje ve vývojovém cyklu N. caninum v úloze definitivního hostitele, ale může být také mezihostitelem. Pes-definitivní hostitel vylučuje v trusu nevysporulované sférické až subsférické oocysty velké okolo 10 – 14 μm. Sporulace oocyst trvá asi 3 dny. Patentní perioda bývá dlouhá jen několik dní, ale může trvat i měsíce. Množství vylučovaných oocyst je velmi variabilní.
U psů (v roli mezihostitelů) je N. caninum zahrnována do diferenciální diagnostiky neuromuskulárních onemocnění. U štěňat se kongenitální neosporóza manifestuje ataxií nebo parézou pánevních končetin, případně i hrudních končetin a svalů krku a hlavy. U starších psů byly kromě těchto příznaků zjištěny myokarditidy, pneumonie či dermatitidy. Dalšími mezihostiteli mohou být: skot, koně, ovce, kozy, dále někteří volně žijící přežvýkavci, koňovití a šelmy. Největší klinický dopad má neosporóza u skotu.Výrazné ekonomické ztráty v chovech masného i mléčného skotu jsou důsledkem poruch plodnosti, abortů, předčasných porodů či zvýšené mortality novorozených telat. Transplacentárně infikovaná telata se mohou narodit zcela bez klinických příznaků, případně s nižší porodní hmotností a sníženou životaschopností následovanou horšími přírůstky. N. caninum však může u novorozených telat vyvolávat také nervové příznaky – parézy až paralýzy hrudních a v některých případech i pánevních končetin, hydrocefalus, exoftalmus. U dospělého skotu ke klinicky zjevnému postižení nervové tkáně nedochází.5 Nervové příznaky neosporózy byly zaznamenány také u koní.6
Rod Hammondia
Je druhým rodem podčeledi Toxoplasmatinae a jsou do něj řazeny druhy H. hammondi, H. pardalis a H. heydorni. Definitivními hostiteli H. hammondi a H. pardalis jsou kočkovité šelmy, zatímco u H. heydorni jsou jimi šelmy psovité. Přirozenými mezihostiteli H. heydorni jsou přežvýkavci a k experimentálním infekcím jsou vnímavá morčata.7 Na základě omezených znalostí se zdá, že H. heydorni je oproti N. caninum kokcidie nepatogenní jak pro definitivního hostitele, tak pro mezihostitele a její veterinární význam zřejmě spočívá právě v nutnosti jejího odlišení od patogenní N. caninum.
Diferenciální diagnostika oocyst kokcidií v trusu psa
Zatímco rody Sarcocystis a Isospora můžeme při interpretaci výsledků flotačního vyšetření trusu psa snadno odlišit podle morfologie nalezených stadií (viz výše), oocysty kokcidií v rámci podčeledi Toxoplasmatinae jsou morfologicky zcela neodlišitelné. Z toho plyne, že nález oocyst měřících 10 – 14 µm může u psa znamenat jak infekci N. caninum tak H. heydorni.
K diagnostice neosporózy je u psa, podobně jako u skotu, možno využít sérologické metody, např. IFAT (indirect fluorescent antibody test), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) nebo aglutinační testy. K dispozici je řada komerčně vyráběných diagnostických setů. Přítomnost protilátek u psa dobře koreluje s výskytem klinických příznaků neosporózy, tj. se situací, kdy pes figuruje v roli mezihostitele a parazit se množí nepohlavně v jeho tkáních. Bohužel jiná je situace při pohlavní fázi množení parazita (pes jako definitivní hostitel), kdy jsou trusem vylučovány oocysty. V těchto případech je samotná přítomnost i hladina protilátek variabilní a jako taková k diferenciální diagnostice v podstatě nevyužitelná.
Dokladem toho, že pes opravdu figuruje jako definitivní hostitel výše zmíněných kokcidií i v České republice, je nález oocyst jednoho izolátu N. caninum a tří izolátů H. heydorni v trusu psů.3,8 Vzhledem k uvedeným skutečnostem byla na Ústavu parazitologie FVL VFU Brno ověřena a potvrzena využitelnost molekulárně biologických metod k odlišení oocyst neospor a hammondií v trusu psů.
Principem metody je detekce přítomnosti specifického úseku DNA vybraného parazita. Tomu předchází izolace DNA z oocyst. Nejprve se nalezené oocysty koncentrují a čistí např. flotační metodou. Po té je nutné narušit jejich stěnu a získat čistou DNA např. pomocí izolačního kitu. Získaná DNA se dále použije v polymerázové řetězové reakci (PCR). V této reakci je kromě DNA nutná přítomnost specifických oligonukleotidů (slouží jako základ pro tvorbu nových řetězců DNA), jednotlivých nukleotidů (stavební prvky DNA) a DNA-polymerázy (enzym umožňující tvorbu nového řetězce DNA spojováním jednotlivých nukleotidů). V reakci dojde vlivem vyšší teploty k rozdělení dvoušroubovice DNA, poté při teplotě nižší nasednou v odpovídajícím úseku specifické oligonukleotidy (primery) a následuje tvorba nového řetězce. Stejné schéma se opakuje v několika (nejčastěji 30 – 40) cyklech a výsledkem je namnožení předem určeného úseku DNA o přesně daném počtu párů bazí až po práh detekovatelnosti. Ke stanovení přítomnosti hledaného úseku DNA slouží separace molekul DNA podle velikosti v agarózovém gelu elektroforézou a jejich zviditelnění pomocí ethidium bromidu v UV světle.
Protože se v našem případě jedná o parazity dva, má tato diagnostika dvě v podstatě shodné části. Nejprve ve vyizolované celkové DNA zjišťujeme přítomnost DNA N. caninum, kdy je cílovým úsekem Nc5 region DNA, který se nalézá pouze v genomu neospory a je k její diagnostice běžně využíván. Pomocí specifických primerů (Np6plus a Np21plus) je amplifikována a posléze detekována část Nc5 regionu o velikosti 337bp (párů bází).
Druhou fází je zjišťování přítomnosti DNA H. heydorni. K tomu je využíván region ITS1 (internal transcribed spacer 1) ribozomální DNA. Gen ITS1 rRNA, v genomu přítomný v několika kopiích, je druhově konzervativním úsekem standardně využívaným při sekvenaci kokcidií. Druhově specifické primery pro H. heydorni (JS4 a JS5) umožňují amplifikaci části ITS1 genu o velikosti 267bp.
Specificita primerů a dostatečně vysoká teplota pro nasednutí primerů na DNA zajišťují spolehlivost výsledků. Že jsou zvolené primery skutečně specifické, bylo vědci ověřováno na DNA dalších parazitů, především těch běžně přítomných v trusu psa (Toxocara canis, Toxascaris leonina, Trichuris vulpis, Sarcocystis sp., Isospora ohionensis-group, Isospora canis, Cryptosporidium parvum, z ostatních především Toxoplasma gondii). Pro odhalení pravdivosti výsledků každé reakce je vždy prováděna pozitivní a negativní kontrola. Pozitivní kontrola obsahuje DNA hledaného parazita, prokazuje funkčnost reakce a její pomocí lze také prokázat, že reakce není inhibována vyizolovanou DNA. Negativní kontrola obsahuje buď vodu (určenou pro PCR) nebo vzorek DNA bez přítomnosti DNA detekovaného parazita a slouží k odhalení případné kontaminace či jinak způsobené falešné pozitivity výsledku.
Přítomnost obou kokcidií v jednom vyšetřovaném vzorku není vyloučena.
Ke stanovení přítomnosti hammondií či neospor z trusu postačuje již množství DNA odpovídající deseti oocystám. Metoda je využitelná i k detekci výše uvedených parazitů v tkáních mezihostitelů. Při detekci z tkání je uváděna citlivost zachycení DNA i jediného prvoka.
Výhodou diagnostického PCR je přesné určení kokcidie během poměrně krátké doby (během asi 24 h) a možnost provedení metody v každé molekulárně biologicky vybavené laboratoři. Finanční náklady jsou oproti koprologickému vyšetření vyšší, ale odpovídají např. některým vyšetřením sérologickým. V současné době nepatří diferenciální diagnostika kokcidií pomocí molekulárně biologických metod mezi rutinní diagnostické metody, provádí je pouze specializovaná pracoviště a největší míra jejich využití spadá do vědecko-výzkumné oblasti.
Tímto článkem bychom rádi upozornili na pokračující výzkum N. caninum na Ústavu parazitologie VFU Brno a vyzvali všechny veterinární lékaře, kteří mikroskopicky vyšetřují trus psů, aby nás při nálezu oocyst isosporového typu, které spadají svojí velikostí do kategorie Neospora/Hammondia (tj. 10 – 14 μm), kontaktovali, materiál nám laskavě poskytli pro genotypizaci a přispěli tak snaze o další poznání těchto parazitů.
Literatura:
1. Koudela B., Svoboda M., Björkman C., Uggla A. První případ neosporózy v České republice. Med Vet – Czech 1998;43:51-54.
2. Václavek P., Koudela B., Modrý D., Sedlák K. Seroprevalence of Neospora caninum in aborting dairy cattle in the Czech Republic. Vet Parasitol 2003;115:239-245.
3. Šlapeta J. R., Koudela B., Votýpka J., Modrý D., Hořejš R., Lukeš J. Coprodiagnosis of Hammondia heydorni in dogs by PCR based amplification of ITS 1 rRNA: Differentiation from morphologically indistinguishable oocysts of Neospora caninum. Vet J 2002;163:147-154.
4. Koudela B., Modrý D. Vývojový cyklus kokcidie Neospora caninum objasněn. Veterinářství 1998;10:434-435.
5. Dubey J. P., Lindsay D. S. A review of Neospora caninum and neosporosis. Vet Parasitol 1996;67:1-59.
6. Marsh A. E., Barr B. C., Madigan J., Lakritz J., Nordhausen R., Conrad P. A. Neosporosis as a cause of equine protozoal myeloencephalitis. J Am Vet Med Assoc 1996;209:1907-1913.
7. Dubey J. P. Hammondia. In: Kreier J. P. Parasitic protozoa Volume 6. San Diego. Academic press, Inc., 1993:67-79.
8. Šlapeta J. R., Modrý D., Kyselová I., Hořejš R., Lukeš J., Koudela B. Dog shedding oocysts of Neospora caninum: PCR diagnosis and molecular phylogenetic approach. Vet Parasitol 2002;109:157-167.
9. Carreno R. A., Barta, J. R. An eimeriid origin of isosporoid coccidia with stieda bodies as shown by phylogenetic analysis of small subunit ribosomal RNA gene sequences. J Parasitol 1999;85:77-83.
10. Modrý D., Šlapeta, J. R., Jirků, M., Oborník, M., Lukeš, J., Koudela, B. Phylogenetic position of a renal coccidium of the European green frogs, Isospora lieberkuehni Labbé, 1894 (Apicomplexa: Sarcocystidae) and its taxonomic implications. Int J Syst Evol Microbiol 2001;51:767-772.
*Rod Isospora je stále ještě často řazen do čeledi Eimeridae. Recentní poznatky ale ukazují, že se jedná o rod polyphyletický. Na základě sekvenace DNA a následných molekulárně phylogenetických analýz se ukázalo, že isospory se Stiedovými tělísky jsou blíže příbuzné eimeriím, ovšem isospory bez Stiedových tělísek (tzn. mimo jiné také isospory parazitující u psa a kočky) jsou více příbuzné sarkocystám a měly by být řazeny do čeledi Sarcocystidae.9,10
Adresa autora:
MVDr. Lada Hůrková
Ústav parazitologie FVL VFU Brno
Palackého 1 – 3
612 42 Brno
e-mail: lhurkova@vfu.cz, Lada.Hurkova@seznam.cz
