T. KOMPRDA
Ústav technologie potravin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně
Veterinářství 2009;59:39-43.
SOUHRN
Komprda T. Heterocyklické aromatické aminy: analýza alimentárního rizika.
Heterocyklické aromatické aminy (HAA) jsou látky s mutagenním a karcinogenním potenciálem, vznikající při tepelných úpravách potravin obsahujících dusíkaté komponenty a cukry. Odhad rizika HAA ztěžuje obtížná extrapolace toxikologických údajů ze zvířat na člověka, značné mezidruhové rozdíly v katalytické aktivitě enzymů metabolizujících xenobiotika (XME), vysoký stupeň polymorfizmu XME u člověka a současná přítomnost jiných mutagenů v inkriminovaných potravinách. Z důvodu obtíží při odvození vztahu mezi dávkou HAA a odezvou (vznik tumoru) dosud nebyly stanoveny toxikologické limity obsahu HAA v potravinách. Rizikovým faktorem vzniku rakoviny vlivem HAA je příjem tepelně upraveného (pečení, smažení, grilování) tzv. červeného masa. Hodnota teoretického odhadu rizika rakoviny vlivem HAA je v řádu 10-4. Nejdůležitější opatření ke snížení příjmu HAA se týkají způsobů tepelné úpravy pokrmů v domácnosti: dávat přednost vaření, dušení a mikrovlnnému ohřevu; grilovat, smažit a péci maso a ryby při teplotě pod 180 °C; odstraňovat povrchovou „kůrku“ a především připálené části smaženého, grilovaného a pečeného masa, drůbeže a ryb.
SUMMARY
Komprda T. Heterocyclic aromatic amines: food-borne risk analysis.
Heterocyclic aromatic amines (HAA) are substances with mutagenic and carcinogenic potential. They are formed during cooking of foods containing nitrogenous components and sugars. HAA risk assessment is difficult due to the problems with extrapolation of the toxicological data from animals to humans, great interspecies differences in the catalytic activity of the xenobiotics metabolizing enzymes (XME), high level of XME polymorphism in humans and a simultaneous presence of other mutagens in the pertinent foods. The toxicological limits of HAA content in foods had not been yet established due to the difficulties in evaluating the relationship dose – response (tumor formation). Intake of broiled, fried or grilled red meat has been suggested as a risk factor of HAA-dependent tumor development. The value of the theoretical cancer risk due to the HAAs is in order of 10-4. The most important measures to decrease HAA intake regard household food preparation: to prefer boiling, stewing and microwaving; to grill, fry and broil meat and fish at the temperature
Analýza alimentárního rizika
Správné vyhodnocení alimentárního rizika je nezbytným předpokladem pro eliminaci tohoto rizika. Důležitým navazujícím krokem je přenos a sdílení informací o alimentárních rizicích. Zhodnocení alimentárního rizika je možno shrnout do čtyř na sebe navazujících kroků: identifikace nebezpečí, charakterizace nebezpečí, odhad expozice, charakterizace alimentárního rizika.1
Účelem identifikace nebezpečí je odhalit relevantní alimentární nebezpečí v dané potravině, tedy ty činitele nebo situace při zacházení s potravinou, jež mohou vést k ohrožení zdravotního stavu konzumenta. Charakterizace alimentárního nebezpečí je záležitostí kvantitativní: jde o vztah mezi dávkou (množstvím) daného nebezpečí v potravině a odezvou, tedy závažností příslušné zdravotní újmy. Odhad expozice je možno (pro chemické látky) definovat jako pravděpodobnost výskytu daného alimentárního nebezpečí v potravině v množství přesahujícím tolerovatelný denní příjem v okamžiku konzumace dané potraviny. Uvedenou pravděpodobnost je možno odhadnout jako superpozici prevalence daného nebezpečí v potravině a početnosti populace konzumující tuto potravinu. Na základě tří výše popsaných kroků je možno charakterizovat alimentární riziko jako odhad pravděpodobnosti a závažnosti zdravotního postižení vlivem daného alimentárního nebezpečí šířícího se potravinami v dané populaci.
V případě heterocyklických aromatických aminů (HAA) je aplikace posledních tří ze čtyř uvedených kroků velice obtížná, což je rozvedeno v následujícím textu.
Identifikace
HAA jsou látky se značným mutagenním a karcinogenním potenciálem, vznikající v potravinách obsahujících dusíkaté komponenty (bílkoviny, kreatin/kreatinin) a redukující cukry (hexózy), a to při tepelných úpravách v rozmezí 100 – 300 °C.2 Dusíkaté heterocykly, které spoluvytvářejí molekuly příslušných HAA jsou znázorněny na obr. 1, chemické vzorce nejvýznamnějších HAA uvádí obr. 2.
Podle teploty vzniku se HAA rozdělují na dvě základní skupiny, termické (vznik při nižší teplotě) a pyrolytické (vyšší teplota) HAA.3 HAA první skupiny jsou látky polární, pyrolytické HAA jsou nepolární. Z třiceti HAA, které uvádí přehled autorů Aleajos et al.,3 jsou na obrázku 2 a v následujícím textu zmíněny jen významné příklady. Mezi termické HAA patří deriváty imidazopyridinu, imidazochinolinu a imidazochinoxalinu. Pyrolytické nepolární HAA jsou též označovány jako karboliny a patří mezi ně deriváty fenylpyridinu, pyridoindolu, pyridoimidazolu, tetraazofluorantenu, benzimidazolu a karbazolu.
Pro vznik termických polárních HAA v potravinách byly navrženy dvě paralelní dráhy obr. 3).6 Základem obou drah je Maillardova reakce zahrnující Amadoriho přesmyk. V průběhu reakcí dochází k fragmentaci sacharidu a vzniku volných radikálů. Imidazochinolinové mutageny jsou tvořeny přes glyoxalalkylimin následnou reakcí alkylpyridinového radikálu s kreatininem, v případě imidazochinoxalinových derivátů postupuje sled kroků přes glykoaldehydimin a reakci dialkylpyrazinového radikálu s kreatininem. Glykoaldehydový systém reaguje rychleji a produkuje více volných radikálů než systém glyoxalový, což vysvětluje vyšší výskyt imidazochinoxalinových mutagenů v tepelně opracovaném mase ve srovnání s deriváty imidazochinolinu.
Charakterizace
U chemických nebezpečí obecně lze jejich charakterizaci provádět pomocí testů in vitro, resp. in vivo na zvířecích modelech. Mutagenní potenciál HAA je testován pomocí Amesova testu (kmeny bakterie Salmonella typhimurium nesoucí mutace genů metabolické dráhy syntézy histidinu; testuje se schopnost dané látky způsobit zpětnou mutaci s důsledkem opětovné schopnosti bakterie růst na médiu bez histidinu). V tomto testu vykazují HAA různý stupeň mutagenity.5 Při testování na eukaryontních buňkách jsou zjišťovány chromozomální aberace a výměny sesterských chromatid.3
Podrobný přehled silných a slabých stránek zvířecích modelů pro testování toxicity uvádí autoři Barlow et al.4 Pro testování látek s předpokládaným karcinogenním účinkem jsou vyžadovány nejméně dva modelové organizmy (myš, krysa), karcinogenní potenciál HAA je nejčastěji testován v následujících tkáních: játra, tračník a konečník, mléčná žláza, prostata, plíce.3
Klasickým výstupem testování toxicity chemických látek na základě vztahu dávka-odezva je odvození toxikologických/legislativních limitů (v české potravinářské legislativě nejvyšší přípustné množství, NPM, v µg na kg potraviny) na základě zjištění hodnot NOAEL (No-Observed-Adverse-Effect-Level; dávka, která při celoživotní konzumaci nevyvolá u pokusných zvířat měřitelný negativní účinek; v µg na kg živé hmotnosti a den) po přepočtu na hodnoty ADI (Acceptable Daily Intake, tolerovatelný denní příjem; v µg na kg tělesné hmotnosti člověka a den).4
Charakterizace genotoxických látek (HAA) je tradičně založena na předpokladu neexistence prahové hodnoty na křivce dávka-odezva, mnoho autorů však obhajuje existenci „praktické prahové hodnoty“ v závislosti na biologických faktorech, kinetice reparace DNA, resp. stimulaci buněčného dělení. Na druhé straně může nízká dávka stresoru (mutagenu) mobilizovat obranné buněčné mechanizmy s důsledkem snížené incidence tumorů (fenomén „hormeze“).7
Největším problémem při odhadu rizika HAA je však vysoký stupeň nejistoty při extrapolaci toxikologických údajů ze zvířecích modelů na hodnoty relevantní pro člověka z důvodu významného vlivu dávky (množství HAA podávané pokusným zvířatům je řádově vyšší než reálný příjem u člověka), značných mezidruhových rozdílů v katalytické aktivitě enzymů metabolizujících xenobiotika (XME), vysokého stupně polymorfizmu XME a značného vlivu různých složek potravy u člověka.8
Pokud jde o XME, důležitá je v tomto kontextu skutečnost, že HAA jsou prekarcinogeny, které se stávají mutageny a vlastními karcinogeny až po metabolizování XME v savčím organismu: enzymy fáze I (PIE) a enzymy fáze II (PIIE). Úkolem PIE je aktivace původně chemicky relativně nereaktivních xenobiotik. Nejvýznamnějším enzymem této skupiny je cytochrom P 450 (CYP). PIIE katalyzují následné konjugační rekce, kterými jsou aktivovaná xenobiotika detoxifikována a postupně odstraněna z organizmu. Savčí organizmus využívá především: UDP-glukuronosyltransferasu (UGT), sulfotransferasu (SULT), N-acetyltransferasu (NAT), glutathion-S-transferasu (GST). Kromě GST se na metabolizování HAA podílí i glutathion (GSH) jako takový. Zjednodušená metabolická dráha vedoucí od intaktních HAA až ke tvorbě DNA adduktu (podstata genotoxického účinku HAA) je znázorněna na obr. 4.
V případě HAA mohou některé detoxifikační enzymy působit i aktivačně. Acetylace a sulfonace pravděpodobně v určitých situacích probíhají jako konkurenční metabolické dráhy; HAA jsou přednostně metabolizovány NAT, sulfonace nabývá na významu pouze u jedinců s pomalou acetylací.
Typickým příkladem mezidruhových rozdílů je mnohonásobně vyšší katalytická aktivita lidského CYP nebo podstatně vyšší podíl HAA transformovaných na N-glukuronid u člověka ve srovnání s pokusnými hlodavci.
Rozsah exprese genu pro CYP v játrech se v rámci různých lidských populací liší až šedesátinásobně. Např. genotyp CYP1A1*2C znamená vyšší riziko vzniku rakoviny tlustého střeva ve srovnání s genotypem CYP2A6*2.
Mnoho epidemiologických studií prokázalo rozdíly v riziku vzniku rakoviny především v důsledku interindividuálních rozdílů mezi lidmi v aktivitě detoxifikačních enzymů.8 V případě SULT jsou zjišťovány velké rozdíly v bioaktivaci N-hydroxy HAA. Zajímavý je z tohoto hlediska kodon 213, kde genotyp His/His se sníženou N-sulfatační aktivitou vede ke snížení rizika rakoviny prsu ve srovnání s variantou Arg/Arg8. Obdobně alela SULT1A1*1 znamenající vysokou aktivitu sulfotransferasy zvyšuje riziko vzniku rakoviny prostaty oproti odpovídající variantě s nízkou aktivitou.3 A1 genotyp tohoto enzymu dále zvyšuje riziko rakoviny tlustého střeva.
Značná variabilita existuje v lidské populaci také ohledně aktivity NAT. Vysoká aktivita (rychlá acetylace N-hydroxy HAA) v lidském kolonu vede ke zvýšení rizika rakoviny tlustého střeva. Naopak genotyp znamenající pomalou acetylaci (NAT2*6/NAT2*6) propůjčuje svým nositelům určitou ochranu proti rakovině prostaty.3
GST inaktivuje v játrech N-acetoxy PhIP; u nositelů genotypu *B/*B (ve srovnání s variantou *A/*A) však značná část N-acetoxy PhIP unikne inaktivaci a dostává se následně do kolonu, cílového orgánu PhIP, kde však gen pro GST není téměř exprimován. V důsledku toho mají lidé s genotypem *B/*B zvýšené riziko rakoviny kolonu. Homozygotní delece v genu pro GST (genotyp GSTM1) vedoucí ke snížené produkci isoenzymu má za následek zvýšení rizika rakoviny tlustého střeva.
Výše uvedené mezidruhové a interindividuální rozdíly v expresi genů pro enzymy aktivující a detoxifikující HAA a z toho plynoucí značné obtíže při odvození vztahu mezi dávkou HAA a odezvou (vznik tumoru) mají za následek, že dosud nebyly stanoveny závazné limity obsahu HAA v potravinách.
Expozice
Pro odhad expozice HAA je nezbytné mít k dispozici spolehlivou analytickou metodu stanovení těchto mutagenů v potravinách a dále reálně odhadnout denní příjem HAA z těch potravin, které jsou jejich rozhodujícím zdrojem. Tak jako ve výše zmíněném případě stanovení vztahu dávka-odezva, i spolehlivý odhad expozice činí značné problémy.
Analytika HAA je velmi náročná, neboť cílem je detekce stopových množství daných látek ve vysoce komplexní matrici příslušných potravin. Izolace analytu zahrnuje extrakci, purifikaci a zkoncentrování, následuje separace pomocí kapalinové nebo plynové chromatografie, resp. kapilární elektroforézy. Detekce může být UV/VIS, fluorescenční, elektrochemická nebo hmotnostní.5 Výsledky různých validovaných analytických metod sice musí být srovnatelné, účinnosti a výtěžnosti jednotlivých postupů se však mohou lišit. Zimmerli et al.7 vypracovali postup založený na extrakci směsí dichlormethan/HCl, alkalizaci vodné fáze supernatantu NaOH, extrakci pevnou fází, přečištění pomocí iontoměničové vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC), separaci pomocí HPLC a detekci při 265, resp. 320 nm. Výtěžnosti se pohybovaly v rozmezí od 59 % (PhIP) do 124 % (MeIQ).
Stěžejní problémy při odhadu příjmu HAA z příslušných potravin (tzv. červené maso, resp. ryby upravované pečením, smažením, grilováním) shrnují Alaejos et al.5 Problematické je např. použití nereálně vysokých teplot a dlouhých intervalů tepelné úpravy v experimentech. Vztahy mezi stupněm opracování a povrchového zhnědnutí (které slouží pro odhad obsahu HAA) masa jsou často nespecifické, neboť použití vysoké teploty po krátkou dobu, resp. nižší teploty po delší dobu může vést ke stejnému stupni povrchového zhnědnutí, avšak velmi rozdílným obsahům HAA. Nejdůležitějším faktorem zde totiž není čas (největší část HAA vzniká během několika minut), ale teplota: např. při pečení při 300 °C vznikne 4x více HAA než při teplotě 200 °C. U pokrmů konzumovaných v rámci společného stravování, včetně rychlého občerstvení, jsou zjišťovány velké rozdíly v obsahu HAA u téhož pokrmu produkovaného různými výrobci. Výsledky získané v rámci jedné populační skupiny nelze aplikovat na jiné populační skupiny, protože metody úpravy potravin a stravovací zvyklosti se mohou podstatně lišit. Obsah HAA ve šťávě z pečeně, pokud se dále konzumuje, může být vyšší než ve vlastním mase. Dotazníky založené na zjišťování frekvence příjmu relevantních potravin jsou zatíženy chybami vlivem záměrné nebo nevědomé předpojatosti respondenta, nekonzistentnosti poskytování údajů, rozdílů v příjmu potravin v různých dnech.
Odhad alimentárního rizika HAA
Na základě výše uvedeného je možno sumarizovat rizikové faktory vzniku rakoviny vlivem HAA.5 Především je to příjem tepelně upraveného tzv. červeného masa (hovězí, telecí, vepřové, skopové, jehněčí). Podle expertů World Cancer Research Fund a American Institute for Cancer Research5 zvyšuje vysoký příjem červeného masa pravděpodobně riziko vzniku rakoviny tlustého střeva a možná riziko rakoviny slinivky, prsu, prostaty a ledvin. Obtížnost odhadu rizika HAA ilustrují výsledky studií naznačující, že konzumace tzv. bílého (drůbežího) masa je spojena se sníženým rizikem rakoviny i v případě, že toto maso obsahuje více HAA než maso červené.5
Pokud jde o tepelné úpravy masa, některé studie prokázaly zvýšení rizika rakoviny tlustého střeva v případě smažení a pečení, což však jiné studie nepotvrdily. Incidence rakoviny prostaty, pankreatu a kolonu byla v pozitivní korelaci s expozicí HAA v případě, kdy sledovaným faktorem variability byl stupeň tepelného opracování: preference pro „dobře udělané“ až „velmi dobře udělané“ maso naznačuje zvýšení rizika rakoviny některých orgánů.5 Podstatou rizikovosti postupů smažení, pečení, resp. grilování je tvorba povrchové „kůrky“ jako výsledek stabilního odvodu vody a v ní rozpuštěných aminokyselin a kreatininu kapilárním transportem směrem k povrchové zóně odpařování, kde dochází ke zkoncentrování prekurzorů HAA a kde je zároveň nejvyšší teplota.
Odhad rizika HAA dále ztěžuje přítomnost jiných mutagenů/karcinogenů v tepelně opracovaných potravinách (polyaromatické uhlovodíky, N-nitrososloučeniny) a současný příjem živočišných tuků (které působí ve střevě jako promotory karcinogeneze) potravinami obsahujícími HAA.
Vzdor všem výše uvedeným obtížím je možné odhadnout teoretické riziko rakoviny vlivem HAA následujícím postupem.7 Podle dotazníku frekvence příjmu potravin se odvodí konzumace masa, drůbeže a ryb v kg na osobu a rok. Rozumným předpokladem při stravovacích zvyklostech střední Evropy je konzumace asi třetiny tohoto množství po tepelné úpravě pečením/smažením/grilováním. Zjištěné množství je přepočteno na gramy na osobu a den. Na základě údajů o koncentraci HAA ve vzorcích takto upraveného masa následuje odhad příjmu HAA v ng na osobu a den. Extrapolací výsledků toxikologického testu na krysách se odvodí souhrnná tumorigenní účinnost pro člověka (v jednotkách [mg kg-1 den-1]-1) při zohlednění korelace mutagenita – karcinogenita. Teoretické riziko je pak vypočteno jako součin tumorigenní účinnosti a denního příjmu HAA. Paralelně je možno teoretické riziko vypočítat pomocí hodnoty TD50 (v mg na kg živé hmotnosti a den), která je v tomto případě definována jako dávka HAA, která při dlouhodobém podávání vyvolá k časovému intervalu konce standardizované délky života tvorbu tumorů u poloviny pokusných zvířat: teoretické riziko = 0,5/TD50 x denní příjem HAA. Zimmerli et al7 odhadli pro švýcarské poměry příjem HAA 330 ng na osobu a den a odpovídající riziko vzniku rakoviny působením HAA 10-5 – 10-4 (pro srovnání: reálné celoživotní riziko zabití bleskem v zeměpisných šířkách ČR je ve stejném rozsahu: 10-5 – 10-4).
Závěr
Pro zpřesnění postupu analýzy rizika HAA by bylo vhodné: založit databázi obsahu HAA v tepelně opracovaných potravinách/pokrmech, která by reprezentovala stravovací zvyklosti dané populace a zohledňovala z uvedeného hlediska všechny ingredience daného pokrmu; dotazníky pro zjišťování četnosti příjmu potravin by měly obsahovat přesný popis vnějšího i vnitřního vzhledu potraviny/pokrmu místo pouhého označení stupně tepelného opracování; zvažovat možnou roli HAA při vzniku nádoru v souvislosti s dalšími toxikanty/mutageny/karcinogeny.
Navzdory skutečnosti, že neexistuje standardní vědecky podložený postup kvantifikace skutečného rizika rakoviny vlivem expozice člověka stopovým množstvím genotoxického karcinogenu (HAA), lze za rozumný odhad rizika považovat v případě HAA hodnotu 10-4. Tato hodnota by již opravňovala použití regulačních opatření ze strany orgánů státního dozoru (v případě masa a masných výrobků Státní veterinární správa, u pokrmů podávaných v rámci společného stravování orgány ochrany veřejného zdraví). Komerčně vyráběné produkty, které mohou být takto regulovány, však přispívají pouze okrajově k celkovému příjmu HAA, jejichž rozhodující podíl vstupuje do organizmu člověka z pokrmů připravovaných v domácnosti. Navíc jsou HAA látky, které vznikají v potravinách přirozeně. Nejdůležitější opatření ke snížení příjmu HAA se tedy týkají způsobů tepelné úpravy pokrmů v domácnosti: dávat přednost vaření, dušení a mikrovlnnému ohřevu; grilovat, smažit a péci maso a ryby při teplotě pod 180 °C; odstraňovat povrchovou „kůrku“ a především připálené části smaženého, grilovaného a pečeného masa, drůbeže a ryb.
Literatura:
1. Smith, M. Food Safety in Europe (FOSIE): risk assessment of chemicals in food and diet: overall introduction. Food Chem Toxicol 2002;40:141-144.
2. Murkovic, M. Chemistry, formation and occurrence of genotoxic heterocyclic aromatic amines in fried products. Eur J Lipid Sci Technol 2004;106:777-785.
3.Alaejos, M. S., Pino, V., Afonso, A. M. Metabolism and toxicology of heterocyclic aromatic amines when consumed in diet: Influence of the genetic susceptibility to develop human cancer. A review. Food Res Int 2008;41:327-340.
4. Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., Carere, A., Carpy, A. J. M., Galli, C. L., Kleiner, J., Knudsen, I., Koeter, H. B. W. M., Levy, L. S., Madsen, C., Mayer, S., Narbonne, J. F., Pfannkuch, F., Prodanchuk, M. G., Smith, M. R., Steinberg, P. Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food Chem Toxicol 2002;40:145-191.
5. Alaejos, M. S., González, V., Afonso, A. M. Exposure to heterocyclic aromatic amines from the consumption of cooked red meat and its effect on human cancer risk: A review. Food Addit Contam 2008;25:2-24.
6. Pearson, A. M., Chen, C. H., Aust, S. D. Mechanism(s) involved in meat mutagen formation and inhibition. Free Rad Biol Med 1992;13:161-167.
7. Zimmerli, B., Rhyn, P., Zoller, O., Schlatter, J. Occurrence of heterocyclic aromatic amines in the Swiss diet: analytical method, exposure estimation and risk assessment. Food Addit Contam 2001;18:533-551.
8. Turesky, R. J. Interspecies metabolism of heterocyclic aromatic amines and the uncertainties in extrapolation of animal toxicity data for human risk assessment. Mol Nutr Food Res 2005;49:101-117.
Adresa autora:
Prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc.
Ústav technologie potravin
Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně
Zemědělská 1
613 00 Brno
