I. STEINHAUSEROVÁ, G. BOŘILOVÁ
Fakulta veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně
Veterinářství 2008;58:315-318.
SOUHRN
Steinhauserová I., Bořilová G.Hodnocení antibiotické rezistence kmenů Campylobacter coli izolovaných z člověka, drůbeže a prasat.
Cílem práce bylo porovnání antibiotické rezistence kmenů Campylobacter coli (C. coli) izolovaných z prasat s drůbežími a humánními kmeny C. coli. Pro vyšetření citlivosti kmenů C. coli k vybraným antimikrobiálním látkám byla použita agarová diluční metoda (NCCLS M11-A6; 2004) a kmeny byly testovány na rezistenci k ampicilinu, tetracyklinu, kyselině nalidixové, chloramfenikolu, erytromycinu, ciprofloxacinu a gentamicinu. V letech 2003 – 2005 bylo vyšetřeno 97 kmenů C. coli izolovaných z prasat, 55 kmenů izolovaných z drůbeže a 77 humánních kmenů C. coli. Při porovnání jednotlivých skupin kmenů C. coli podle původu můžeme konstatovat, že humánní kmeny vykazovaly rezistenci především na fluorochinolonová antibiotika (ciprofloxacin a kyselinu nalidixovou) a nižší výskyt rezistence byl prokázán k ampicilinu a erytromycinu. Z výsledků je zřejmé, že profil antibiotické rezistence humánních kmenů C. coli je mnohem bližší profilu kmenů z drůbeže než z prasat.
SUMMARY
Steinhauserová I., Bořilová G. Evaluation of antibiotic resistance of Campylobacter coli strains isolated from man, poultry and pigs.
The purpose of this presented work was to compare antibiotic resistance of Campylobacter coli (C. coli) strains isolated from pigs to poultry and human strains of C. coli. Sensitivity of C. coli strains to the selected antimicrobials was determined by means of agar dilution method (NCCLS M11-A6; 2004) and strains were tested for resistance to ampicilin, tetracyclin, nalidixic acid, chloramfenicol, erythromycine, ciprophloxacine, and gentamicine. From 2003 to 2005 were examined 97 C. coli strains isolated from pigs, 55 strains isolated from poultry, and 77 strains gained from man. Human strains were particularly resistant to fluoroquinolones (ciprophloxacine and nalidixic acid) and lower resistance was found to ampiciline and erythromycine. From these results follows that the profile of antibiotic resistance of human C. coli strains is more relative to poultry strains than to pig strains.
Úvod
Kampylobakterióza zaujímá v posledních pěti letech přední místo v ČR ve výskytu onemocnění alimentárního původu. Tento stav odpovídá situaci ve vyspělých zemích EU, kde kampylobakterióza spolu se salmonelózou představuje jedno z nejčastějších onemocnění z potravin. I když se ve většině laboratoří druhové určení původce rutinně neprovádí, je známo, že většina případů onemocnění člověka je vyvolána druhem C. jejuni a pouze v některých případech C. coli.1
Campylobacter sp. je součástí mikroflóry střevního traktu řady teplokrevných zvířat, aniž by u nich vyvolával klinické příznaky onemocnění. Velmi častým nositelem kmenů C. jejuni jsou volně žijící ptáci a drůbež. Výskyt u drůbeže se odhaduje na 60 % až 80 %, ale podle některých autorů je častý 100 % nález Campylobacter sp. u kuřat a zejména u krůt. Poměrně četné jsou také pozitivní nálezy u prasat, ale zde bývá izolován zejména C. coli. Také nálezy u ostatních hospodářských zvířat, např. u ovcí a skotu nejsou výjimkou. Promořenost chovů úzce souvisí se způsobem a hygienickými podmínkami chovu.2
Používání antimikrobních látek v zemědělské prvovýrobě má za následek vznik rezistentních kmenů patogenních mikroorganismů včetně Campylobacter sp. Státy EU postupně omezily a v dnešní době i zcela zakázaly používání antibiotik v krmných směsích pro hospodářská zvířata.3 I přes zákaz podávání těchto látek je v řadě států rezistence patogenních mikroorganismů popisována, dlouhodobě sledována a monitorována. V České republice není povinné systematické sledování rezistence Campylobacter sp. a donedávna nebyla ani zavedena metoda hodnocení rezistence Campylobacter sp. Proto byla metoda na našem pracovišti optimalizována a v posledních letech probíhá hodnocení rezistence izolovaných kmenů Campylobacter sp. pocházejících z hospodářských zvířat. Současně je porovnávána rezistence s kmeny humánního původu. Cílem práce je porovnání antibiotické rezistence kmenů C. coli izolovaných z prasat s drůbežími a humánními kmeny C. coli.
Metodika
Vzorky prasat byly odebrány na jatkách formou stěru z povrchu vepřových jatečních půlek a z céka, a ihned převezeny do laboratoře ke kultivaci. Odběry byly prováděny s použitím tampónů s transportním Amiesovým médiem. U drůbeže byl v jatečním provozu (po vykuchání a veterinární prohlídce) odebírán trávicí trakt (střeva) do sterilních PE sáčků a v chladícím boxu převezen do laboratoře, kde byl proveden výtěr z kloaky pomocí sterilního tampónu. Humánní kmeny byly testovány ve spolupráci se SZÚ Praha a byly získány jako výtěry od pacientů trpících průjmovým onemocněním.
Kmen Campylobacter sp. byl detekován pomocí kultivační metody (ČSN ISO 10272) na CAT agaru (Blood-free Agar Base + CAT supplement) po inkubaci v mikroaerofilní atmosféře (Gas Generating Kit CampySystem) 48 hodin při 42 ºC.
K identifikaci a diferenciaci kmenů Campylobacter sp. byla použita polymerázová řetězová reakce s následnou analýzou polymorfismů délky restrikčních fragmentů (PCR/RFLP)4 po amplifikaci DNA ve variabilní oblasti genu 23S rRNA. Jednotlivé druhy Campylobacter sp. byly odlišeny následnou RFLP analýzou PCR produktu o velikosti 491 bp. Štěpením restrikční endonukleázou AluI byly identifikovány kmeny C. jejuni a C. lari a kmeny C. coli a C. upsaliensis byly identifikovány štěpením restriktázou Tsp509I.
Pro určení citlivosti kmenů C. coli k vybraným antimikrobiálním látkám byla použita agarová diluční metoda stanovující minimální inhibiční koncentraci (MIC) antibiotika in vitro, potřebná k inhibici růstu vyšetřovaného mikroba během definované doby. Rezistence kmenů C. coli byla hodnocena vůči sedmi antibiotickým preparátům: ampicilinu, kyselině nalidixové, ciprofloxacinu, gentamicinu, tetracyklinu, erythromycinu a chloramfenikolu, které byly ředěny na výslednou koncentraci 1:28; 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 mg/l; u ciprofloxacinu a gentamicinu byla koncentrace snížena na 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,063 mg/l. Inokulum bylo připraveno z 24 hodinové kultury o výsledné koncentraci 0,5 º McFarlanda. Pro kultivaci byla použita půda Mueller-Hinton agar s přídavkem 5 % ovčí krve a inkubace probíhala za identických podmínek, jako při stanovení výskytu Campylobacter sp. Jako standard byl použit sbírkový kmen Campylobacter coli ATCC43478. Na základě zjištěných hodnot (MIC) byly kmeny posouzeny jako citlivé (S) nebo rezistentní (R) podle NCCLS M11-A6 (2004).
Výsledky
V letech 2003 – 2005 bylo vyšetřeno na antibiotickou rezistenci 97 kmenů C. coli izolovaných z prasat. U těchto kmenů byla zjištěna vysoká rezistence k ciprofloxacinu a erytromycinu. K ciprofloxacinu bylo rezistentních 52 kmenů (54 %) a u zbývajících 33 % kmenů byla rezistence hodnocena jako intermediální. K erytromycinu bylo vyhodnoceno 54 (56 %) kmenů jako rezistentní a 33 % kmenů vykazovalo intermediální rezistenci. Současně byla prokázána i vysoká rezistence k tetracyklinu, kdy z celkového počtu 97 kmenů bylo 60 kmenů (62 %) hodnoceno jako rezistentní. Jedna třetina kmenů byla rezistentní ke kyselině nalidixové. Rezistence k ampicilinu byla nízká (20 %) a k dalším antibiotikům (gentamicinu a chloramfenikolu) jsme rezistentní kmeny prakticky neprokázali.
Ve sledovaném období jsme hodnotili celkem 55 kmenů C. coli izolovaných z drůbeže. Většina kmenů vykazovala rezistenci ke kyselině nalidixové 76 % a 40 kmenů (73 %) bylo rezistentních k ciprofloxacinu. Na rozdíl od kmenů izolovaných z prasat jsme zjistili podstatně nižší rezistenci k erytromycinu a tetracyklinu. K erytromycinu bylo rezistentních pouze pět kmenů (9 %) a k tetracyklinu 11 kmenů (20 %). Současně však bylo 30 kmenů (55 %) hodnoceno jako rezistentních k ampicilinu, což je v porovnání s kmeny z prasat podstatně vyšší záchyt.
Bylo hodnoceno také 77 humánních kmenů C. coli. Nejvyšší hodnoty výskytu rezistence jsme prokázali u ciprofloxacinu, kdy bylo rezistentních 38 kmenů (49 %) a u kyseliny nalidixové, kde z celkového počtu 77 izolátů bylo 23 kmenů rezistentních (30 %). Čtvrtina humánních kmenů byla rezistentní k ampicilinu (20 kmenů) a k erytromycinu (19 kmenů). K těmto dvěma antibiotikům vykazovalo dalších 30 % kmenů intermediální senzitivitu. U žádné sledované skupiny kmenů C. coli jsme neprokázali významné rozdíly rezistence mezi jednotlivými roky ve sledovaném období 2003 – 2005.
Na základě našeho zjištění je možné konstatovat, že kmeny C. coli izolované z drůbeže vykazují vyšší rezistenci k testovaným antibiotikům než kmeny izolované z prasat. Tři čtvrtiny kmenů izolovaných z drůbeže byly rezistentní ke kyselině nalidixové a ciprofloxacinu, zatímco u kmenů izolovaných z prasat se rezistence u nejvíce sledovaných antibiotik (ciprofloxacinu a erytromycinu) pohybovala okolo 55 %.
Diskuse
Primárně se antimikrobiální látky ve veterinární medicíně používají za účelem terapie. Velmi rozšířenou praxí je podávání preventivních dávek antibiotik za účelem profylaxe nebo stimulace růstu, kdy jsou používány preparáty, které nejsou registrovány pro léčbu ve veterinární nebo humánní terapii.6 Právě takovéto užívání antibiotik může vést k selekčnímu tlaku na mikroorganismy a tím ke vzniku celé řady rezistentních kmenů. Z těchto důvodů je používání látek na bázi antimikrobiální účinnosti k jiným než terapeutickým účelům v rámci EU zakázáno.
Výskyt rezistence je obecně vyšší u kmenů C. coli než u C. jejuni a to platí především pro rezistenci k makrolidům. Vysoké hodnoty výskytu makrolidové rezistence jsou patrné zejména u kmenů C. coli izolovaných z prasat. Výskyt erytromycin-rezistentních kmenů u prasat ve Velké Británii je značně vysoký, uvádí se 84 % rezistentních kmenů v roce 2001. Dvě třetiny ciprofloxacin-rezistentních kmenů byly také rezistentní k erytromycinu.7 Rezistence těchto kmenů k makrolidům a fluorochinolonům je všeobecně vysoká, zatímco rezistence k ostatním antimikrobním látkám včetně tetracyklinu, amiloglykosidů a chloramfenikolu je poměrně nízká. Také rezistence k beta-laktamovým antibiotikům a sulfonamidům je u C. coli všeobecně velmi vysoká.8
Rezistence k makrolidovým antibiotikům je založena na různých mechanismech. Jedná se o specifickou metylaci adeninů cílového místa makrolidů na 23S rRNA, která může být determinována geneticky (mutací).8 Vysoká frekvence výskytu rezistence k makrolidovým antibiotikům u kmenů C. coli pocházejících z prasat je zřejmě zapříčiněna vysokým selekčním tlakem na bakterie vyvíjeným např. podáváním tylosinu jako růstového stimulátoru. Nicméně užívání tohoto přípravku jako stimulátoru a profylaktika bylo od roku 1999 zakázáno.8 Také naše výsledky ukazují vysokou rezistenci izolovaných kmenů C. coli z prasat k erytromycinu ve srovnání s kmeny izolovanými od člověka nebo z drůbeže.
Vedle rezistence k makrolidům je u Campylobacter sp. často popisována i rezistence k chinolonovým antibiotikům. Fluorochinolon enrofloxacin byl používán ve veterinární medicíně od roku 1987 a do počátku 90. let k němu nebyly zjištěny rezistentní kmeny Campylobacter sp. V roce 1992 bylo v Holandsku zjištěno 29 % fluorochinolon- rezistentních kmenů u drůbeže a u humánních kmenů byla rezistence zachycena v roce 1997. Podobná situace v rezistenci na chinolonová antibiotika byla zaznamenána v Rakousku, Dánsku, Finsku, Francii, Itálii, Španělsku, Velké Británii i v USA.3
Fluorochinolonová antibiotika inhibují aktivitu DNA gyrazy a u většiny bakteriálních druhů je rezistence způsobena díky mutacím v genech gyrazy nebo topoisomerázy.7 U kmenů Campylobacter sp. je fluoroquinolonová rezistence vyvolána díky mutacím v genu gyrA a to na pozici Thr-86, Asp-90 a Ala-70.
Bylo zjištěno, že po podání antibiotik následuje poměrně dlouhá doba vylučování rezistentních kmenů Campylobacter sp. Při podávání enrofloxacinu po dobu pěti dnů pětitýdenním selatům s nativním osazením střeva C. coli bylo zjištěno, že selata vylučovala enrofloxacin-rezistentní kmeny až do 35. dne po skončení podání léčebné dávky. Tyto kmeny vykazovaly rezistenci k ciprofloxacinu a také ke kyselině nalidixové a u každého kmene byla prokázána mutace způsobující substituci Thr-86-Ile v gyrA.7 Tyto výsledky korespondují s nálezy při podávání enrofloxacinu u drůbežího modelu. Ačkoliv podávané léčebné dávky jsou asi 6x vyšší u drůbeže než u prasat, nebezpečí zvýšeného výskytu ciprofloxacin-rezistentních bakterií je až čtyři týdny po skončení podávání antibiotika.7 Tyto poznatky jsou závažné v tom, že představují možnost kontaminace povrchů těla rezistentními kmeny C. coli při porážení.
Rezistence k ciprofloxacinu byla podle našich výsledků vysoká u všech izolovaných kmenů C. coli bez ohledu na původ kmenů. Velmi vysoká rezistence byla k ciprofloxacinu a kyselině nalidixové především u drůbežích kmenů, kde jsem prokázali prakticky 75 % kmenů rezistentních k těmto antibiotikům. Také u humánních kmenů byla rezistence C. coli vůči ciprofloxacinu nejvyšší ze všech hodnocených antibiotik.
S výjimkou makrolidů, fluochinolonů a tetracyklinů není rezistence k antimikrobním látkám u Campylobacter sp. příliš rozšířena. Rezistence k aminoglykosidům a chloramfenikolu je stále poměrně nízká. Rezistence k makrolidovým a fluorochinolonovým antibiotikům je způsobena chromozomovými mutacemi, nikoliv horizontálně přenášenými geny. Nicméně některé poznatky hovoří o možnosti přenosu rezistence mezi jednotlivými bakteriálními druhy.8
Riziko výskytu rezistentních nebo multirezistentních kmenů je často mnohem vyšší v rozvojových zemích, kde kontrola podávání antibiotik nebo stimulátorů růstu hospodářským zvířatům je nedostatečná. Například v Keni je 51 % kmenů Campylobacter sp. izolovaných od pacientů s průjmy multirezistentních, přičemž 24 % je rezistentních ke kyselině nalidixové. Podobná situace byla popsána v Tchajwanu, kde je 50 % humánních kmenů rezistentních k erytromycinu, nebo v Thajsku, kde se díky masivnímu podávání fluorochinolonů drůbeži jako preventerů respiračních onemocnění, zvýšila rezistence k této skupině antibiotik z 0 % v roce 1987 na 84 % v roce 1995.9 Většina onemocnění způsobená Campylobacter sp. má u pacientů s dobře fungujícím imunitním systémem mírný průběh bez potřeby podávání antibiotik. Nicméně s narůstajícím počtem pacientů s oslabeným imunitním systémem vzrůstá i počet případů podávání antimikrobiálních látek při vzniku onemocnění. Antibiotiky první volby bývají právě makrolidy (erytromycin) a fluorochinolony (ciprofloxacin). Ve Velké Británii bylo zjištěno, že humánní kmeny C. coli vykazují rezistenci častěji než humánní kmeny C. jejuni. Každý čtvrtý kmen C. coli izolovaný z člověka je rezistentní na ciprofloxacin ve srovnání s každým pátým kmenem C. jejuni. Výskyt rezistence byl potvrzen u 19 % kmenů C. coli ve srovnání s 1 – 3 % výskytem rezistence u kmenů C. jejuni.7 Také průběh onemocnění může být komplikovanější, pokud je onemocnění vyvoláno rezistentními kmeny. U pacientů, kteří onemocněli kampylobakteriózou vyvolanou ciprofloxacin-rezistentním kmenem byla doba onemocnění signifikantně delší než u pacientů, u nichž onemocnění vyvolal ciprofloxacin-senzitivní kmen.10
Závěr
Při porovnání jednotlivých skupin kmenů C. coli podle původu můžeme konstatovat, že v námi hodnoceném souboru vykazovaly humánní kmeny C. coli rezistenci především k fluorochinolonovým antibiotikům (ciprofloxacin, kyselina nalidixová) a nižší výskyt rezistence byl prokázán vůči ampicilinu a erytromycinu. Z výsledků je zřejmé, že profil antibiotické rezistence humánních kmenů C. coli je mnohem bližší profilu kmenů z drůbeže než z prasat Tato skutečnost by také více odpovídala možnostem přenosu kmenů z potravin na člověka. Přežívání kmenů Campylobacter sp. na povrchu vepřového masa je mnohem složitější a méně pravděpodobné než na povrchu drůbeže, kde jsou vytvořeny vhodné podmínky pro přežívání Campylobacter sp. Jedná se především o charakter povrchu drůbeže, kde se v péřových folikulech udržuje vhodná vlhkost a snížení přístupu kyslíku u balené drůbeže usnadňuje přežívání tohoto patogena.
Literatura:
1. Steinhauserová, I., Nebola, M. Je drůbež nejčastější příčinou onemocnění kampylobakteriózou u člověka? Veterinářství 2002;52:63-65.
2. Moore, J. E., Garcia, M. M., Madden, R. H. Subspecies characterization of porcine Campylobacter coli and Campylobacter jejuni by multilocus enzyme electrophoresis typing. Veterinary Research Communications 2002;26:1-9.
3. Teuber, M. Veterinary use and antibiotic resistance. Current Opinion in Microbiology 2001;4:493-499.
4. Fermér, Ch., Engvall, E. O. Specific PCR Identification and Differentiation of the Thermophilic Campylobacters, Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari and Campylobacter upsaliensis. Journal of Clinical Microbiology 1999;37: 3370-3373.
5. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria-Sixth Edition: Approved Standard M11-A6. 2004: NCCLS, Villanova, PA, USA.
6. Hera, A., Billová, V., Novotná, P. Antibiotická politika ve veterinární medicíně. Veterinářství 2002;52:246-249.
7. Delsol, A. A., Sunderland, J., Woodward, M. J., Pumbwe, L., Piddock, L. J., Roe, J. M. Emergence of fluoroquinolone resistance in the native Campylobacter coli population of pigs exposed to enrofloxacin. J Antimicrob Chemother 2004;53:872-874.
8. Aarestrup, F. M., Engberg, J. Antimicrobial resistance of thermophilic Campylobacter. Veterinary Research 2001;32:311-321.
9. Padungton, P., Kaneene, J. B. Campylobacter spp. in human, chickens, pigs and their antimicrobial resistance. J Vet Med Sci 2003;65:161-170.
10. Nelson, J. M., Smith, K. E., Vugia, D. J., Rabatsky-Ehr, T., Segler, S. D., Kassenborg, H. D., Zansky, S. M., Joyce, K., Marano, N., Hoekstra, R. M., Angulo, F. J. Prolonged diarrhea due to ciprofloxacin – resistant Campylobacter infection. J Infect Dis 2004;190:1150-1157.
Adresa autora:
Prof. MVDr. Iva Steinhauserová, CSc.
Fakulta veterinární hygieny a ekologie
Ústav hygieny a technologie masa
Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Palackého 1 – 3
612 42 Brno
e-mail: steinhauserovai@vfu.cz
