Rezistence na chemoterapeutika.
Eimeria tenella je protozoární parazit, který napadá střevní epitel drůbeže a vyvolává enteritidu, typický příznak kokcidiózy. Některé parazitární kmeny jsou rezistentní na chemoterapeutika, a tak se do popředí zájmu dostávají alternativní metody regulace této nemoci. Střevní mikroflóra chrání organismus proti patogenní kolonizaci díky nespecifickému bariérovému efektu, kompetici o místo na povrchu střeva, produkci anti-patogenních produktů, zvýšené imunitní odpovědi nebo kombinací všech těchto uvedených faktorů. Mezi přirozenou mikroflóru patří druhy laktobacilů, které vykazují takové vlastnosti, jako je schopnost adherovat k buňkám, zabraňovat nebo redukovat adherenci patogenů, zachovávat a znásobovat produkci kyselin, peroxidu vodíku a bakteriocinů. Některé druhy rodu Lacobacillus kolonizují gastrointestinální trakt drůbeže, inhibují bakteriální patogeny (Escherichia coli, Salmonella sp.) a ovlivňují parazitární infekce (Cryptosporidium parvum, Eimeria acervulina, Giardia lamblia,G. intestinalis, Trichomonas vaginalis).
V experimentu byly použity oocysty E. tenella (kmen UT1507), ze kterých byli získáni sporozoiti. Z různých částí střeva drůbeže byl izolován Lactobacillus a k pokusu byly vybrány Lb. acidophilus (Lb33ac) a Lb. salivarius (Lb14c7 a Lb16c6). Buněčná linie MDBK byla použita jako ideální model pro invazi E. tenella na buněčné úrovni.
Při testování adherence laktobacilu byly vykultivovány MDBK buňky s izolátem Lb33ac. Adherované bakterie byly pod mikroskopem spočítány. V kompetitivně inhibičním testu byli na souvislé vrstvě buněčné linie MDBK inkubováni současně sporozoiti a Lactobacillus. Buňky byly fixovány a spočítáni intracelulární sporozoiti. U testu extracelulární inhibice byl Lactobacillus pomnožován na MRS médiu nebo na modifikovaném růstovém médiu LmMEM. Supernatanty z těchto médií byly spolu se sporozoity a monolayerem buněk MDBK inkubovány za přítomnosti 3H-uracilu. Dále byly pomnoženy izoláty na MRS médiu, supernatant odstraněn a pelety inkubovány v PBS. Jedna část PBS supernatantu pak byla zahřáta na 100 oC a zchlazena, druhá část byla ponechána tepelně neošetřena. Obě pak byly použity stejným způsobem, jak supernatanty dříve zmiňované. Parazitární invaze byla změřena množstvím inkorporovaného 3H- uracilu. Při určování životaschopnosti buněk, byla buněčná linie MDBK inkubována se všemi použitými médii, jejich viabilita zjištěna barvením trypanovou modří a spočítána.
K adherenci izolátu Lb. acidophilus na MDBK buňky došlo v počátečních 60ti minutách, potom se začal monolayer buněčné linie loupat. Při kompetitivně-inhibičním testu došlo k výrazné inhibici parazitární invaze. Při určování extracelulárního inhibičního faktoru bylo zjištěno, že samotné MRS médium přispívá k dramatickému snížení parazitární invaze. Médium LmMEM ovlivňovalo parazitární invazi mnohem méně. Užitím LmMEM jako inkubačního média byla parazitární invaze inhibována všemi kmeny Lactobacillu, ale nejvíce izolátu Lb16c6 získaného z céka. Jestliže byl použit tepelně neopracovaný PBS supernatant jako kultivační médium, nastala taktéž výrazná parazitární inhibice, přičemž nebyl rozdíl mezi izoláty. Inhibiční efekt Lactobacillu při použití tepelně opracovaného supernatantu se sice výrazně snížil, nicméně byla stále zachována extracelulárně inhibiční schopnost izolátů. Životaschopnost buněčné linie MDBK byla ve všech případech vysoká, pouze použité MRS médium ji snižovalo k hodnotě 88 %.
Model buněčné linie MDBK může poskytnout realistický pohled na práci komplexu ekosystému trávicího traktu, je ideální pro pozorování invaze E. tenella na buněčné úrovni a pro studium role Lactobacillus na invazivní parazity. Přirozená mikroflóra drůbeže je ideálním rezervoárem pro Lactobacillus spp., který přispívá k regulaci parazitární infekce, což dokazuje tato studie in vitro.
Tierney J., Cowing H., Van Sinderen D. et all In vitro inhibition of Eimeria tenella invasion by indigenous chicken Lactobacillus species. Vet Parasitol 2004;122(3):171-182.
