B. ROBEŠOVÁ
Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno
Veterinářství 2007;57:576-579.
SOUHRN
Robešová B. Určení pohlaví jedinců řádu chudozubých metodou PCR.
Problém definování pohlaví se vyskytuje nejen v případě plazů a ptáků, ale v ojedinělých případech i v třídě savců. Metodou PCR bylo stanoveno pohlaví u několika jedinců řádu chudozubých chovaných v ZOO Olomouc. Jako cílová sekvence byla zvolena část SRY genu lokalizovaného na Y chromozómu savců.
SUMMARY
Robešová B. Gender determination in individuals of the order Xenarthra by a PCR method.
Problem in sex determination occurs not only in case of snakes and birds but also in mammals species in sporadic cases. By PCR method was determined the gender in several individuals from the Xenarthra order bred in ZOO Olomouc. As the aim sequention was choosen the part of SRY gene that is localised on the Y chromosome of mammals.
Úvod
V zoologických zahradách jsou chována různá exotická zvířata. Většinou pocházejí z vlastních odchovů, výjimkou však nejsou přírůstky z legálních odchytů ve volné přírodě. Tato zvířata jsou velmi cenná pro svůj genofond. Snahou chovatele logicky zapojit je všechna takto získaná zvířata do chovatelských programů usilujících o zachování daného druhu. Přesné stanovení pohlaví je v tomto případě nezbytné. Řád chudozubých zahrnuje 30 druhů členěných do čtyř čeledí: lenochodovití tříprstí (Bradypodidae), lenochodovití dvouprstí (Megalonychidae), mravenečníkovití (Myrmecophagidae) a pásovcovití (Dasypodidae)). U čeledí pásovcovitých a lenochodovitých je pohlavní diferenciace relativně výrazná, u mravenečníků rodu Tamandua jsou pohlavní orgány vcelku snadno rozlišitelné, avšak u mravenečníků velkých je rozpoznatelnost pohlaví velmi malá, což je navíc komplikováno skutečností, že manipulace s těmito velkými a nebezpečnými zvířaty není možná bez sedace.
Ke stanovení pohlaví lze využít genomovou DNA. V případě savců lze identifikovat samčí jedince zachycením některé ze sekvencí specifických pro samčí pohlavní chromozóm Y.1,2 Jednou z takových sekvencí je SRY gene (sex determining region Y gene), lokalizovaný na krátkém raménku Y chromozomu. Bývá označován jako TDF (testis-determining faktor), jeho rolí je aktivace diferenciace dosud nevyvinutých pohlavních orgánů u jedince v embryonálním stádiu, což má za následek vývoj varlat.3
Metodou PCR (polymerase chain reaction = polymerázová řetězová reakce) lze v poměrně malém množství DNA prokázat přítomnost hledané sekvence. DNA lze získat z krve, stěrů bukální sliznice, případně jiných vzorků tkání, jako jsou např. chlupy.4-6
Gen SRY se v savčím genomu vyskytuje převážně v jedné kopii, kóduje protein tvořený 204 aminokyselinami. Ve středu genu se nachází tzv. HMG box (high mobility group), což je centrální oblast genu tvořená 78 aminokyselinami.7 Různé mutace v HMG boxu mohou vést v krajním případě k absenci samčího vývoje.8 Vzhledem ke konzervativnosti HMG sekvence byly pro určení přítomnosti sekvence SRY v genomu testovaných zvířat zvoleny primery nacházející se v této oblasti – RG4 a RG7.4 Pro vnitřní kontrolu přítomnosti DNA v testovaném vzorku byla provedena i PCR reakce s primery L14724 a H15149, které ohraničují část mitochondriálního genu pro cytochrom b.9
Materiál a metodika
V případě mravenečníků byly zvoleny jako materiál pro izolaci DNA chlupové cibulky, především pro relativní jednoduchost jejich získání. Genomová DNA byla izolována z 15-20 chlupů pomocí soupravy NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel) a extrahována do 100µl elučního pufru. Pro amplifikaci sekvence SRY byly použity primery RG4 a RG7 a pro amplifikaci mitochondriálního genu cytochromu b primery L14724 a H15149 (tab.1).4,9
PCR reakce byly prováděny v 50µl reakční směsi obsahující 1x koncentrovaný reakční pufr (NEB), 5µl DNA extraktu, 0,2µM dNTP, primery RG4, RG7, L14724 a H15149, každý v koncentraci 0,5µM a 0,5U TaqDNA polymerázy (NEB). Amplifikační reakce měla následující teplotní profil: denaturace 94 oC/4min., 40 cyklů – 94 oC/1min, 55 oC/45s, 72 oC/1min, závěrem 72 oC/10min. Produkt byl vizualizován v jednoprocentním agarózovém gelu.
Výsledky
Do Zoologické zahrady Olomouc se v souvislosti s vybudováním nové expozice zvířat Jižní Ameriky dostalo několik zástupců řádu chudozubých (Xenarthra), pocházejících z legálního importu z Jižní Ameriky. Jednalo se o dva lenochody dvouprsté (Choloepus didactylus), dva mravenečníky čtyřprsté (Tamandua tetradactyla) a především o dva mravenečníky velké (Myrmecophaga tridactyla).V kolekci zvířat této zoologické zahrady je i pár pásovců štětinatých (Chaetophractus villosus), pocházejících z odchovu v zajetí.
Pohlavní orgány mravenečníků čtyřprstých jsou poměrně snadno rozlišitelné, zvířata přivezená do olomoucké ZOO jsou pár a v roce 2006 se od tohoto páru podařilo odchovat mládě (obr.2). Pohlavní orgány lenochodů jsou též relativně dobře rozpoznatelné, zvířata chovaná v olomoucké ZOO jsou taktéž pár. Ani po dosažení potřebného věku však u nich nedošlo k rozmnožení ani k žádným projevům pohlavní aktivity. Pásovci štětinatí se naopak rozmnožili opakovaně. Pohlavní orgány těchto zvířat jsou relativně rozpoznatelné, a to alespoň při možnosti vzájemného srovnání obou pohlaví.
V případě mravenečníků velkých přivezených do ZOO Olomouc se jednalo o mláďata, pocházející z odchytu z volné přírody, jejichž věk se odhadoval zhruba na půl roku. V tomto věku byla zvířata sice ještě zvládnutelná, avšak nedostatečně vyvinutá a o jejich pohlaví se pouze spekulovalo. S nástupem dospívání začalo docházet nejprve k pokusům o páření, přičemž však roli samce střídavě přebírali oba jedinci. Později začalo docházet ke konfliktům, které se vyhrotily tak, že bylo nutno mravenečníky rozdělit, aby se vyloučila možnost vzájemného zranění nebo zabití jednoho z nich. Oba tito jedinci pocházející z volné přírody jsou zcela nepříbuzní k ostatním jedincům žijícím v evropských ZOO a pro svůj genofond jsou tedy velmi cenní. Proto bylo přesné určení jejich pohlaví základní úkol.
Byly odebrány vzorky chlupů obou mravenečníků a pro kontrolu také ostatních druhů chudozubých, chovaných v olomoucké ZOO. Jako standard byla použita genomová DNA dvou jedinců Homo sapiens, samčího a samičího pohlaví. V případě všech vzorků je v gelu patrný proužek v oblasti 466pb, amplifikovaný úsek cytochromu b. Existence tohoto proužku potvrzuje přítomnost DNA v PCR reakci. Druhý proužek o velikosti 216pb se pak objevuje pouze u jedinců, kteří ve své DNA mají SRY sekvenci a jedná se tedy o samce. Kromě standardu se potvrdilo pohlaví obou mravenečníků čtyřprstých (jeden je samec a druhý samice), a jejich mláděte (sameček) (obr. 5), v případě lenochodů dvouprstých se jedná o samce a samici. Existence proužku pro SRY sekvenci potvrdila pohlaví mravenečníků velkých – v obou případech se jedná o samce.
Diskuse
V chovu exotů je možné setkat se s problémy ne zcela obvyklými ve veterinární praxi. Pracuje se zde se zvířaty, která nejsou domestikovaná a manipulace s nimi i jejich fyziognomie je mnohdy atypická. Rozlišení pohlaví u savce se na první pohled jeví jako problém, který nemůže vzniknout. Zoologické zahrady se s ním však setkat mohou. Pochopitelně je možná cesta sedace zvířete a jeho sonografické vyšetření. V případě exotů je to však téměř vždy spojeno s rizikem odhadu množství aplikovaných farmak a nejasnost reakce na ně. Nelze většinou vyloučit stres s celým zákrokem spojený, který může zvíře negativně ovlivnit.
Konkrétní problém určení pohlaví mravenečníků lze řešit právě pomocí PCR. Získání několika chlupových cibulek zvíře zvlášť netraumatizuje. Tato metoda byla s úspěchem použita u jiných druhů zvířat – např. u lenochodů a medvědů. 4-6 Sekvencí, specifických pro pohlavní chromozomy, je několik. Často je používaná HMG oblast genu SRY. Vyznačuje se vysokou konzervativností, takže ji lze zachytit u velkého množství savců, bez ohledu na druhovou příslušnost. Zvolíme-li primery, které amplifikují úseky zasahující mimo HMG box, mnohdy zjistíme, že jsou druhově specifické. Primery definované např. pro člověka či slona nám nezachytí třeba právě DNA mravenečníka nebo medvěda. Na elektroforetickém gelu nebude v tomto případě patrný žádný proužek. To ovšem komplikuje situaci, protože nepřítomnost amplifikátu neznamená automaticky nepřítomnost amplifikované sekvence. K neamplifikování cílového úseku mezi primery může dojít z mnoha různých důvodů (mutace v cílovém místě primeru, jeho modifikace a pod.). Z tohoto důvodu je vždy vhodné mít i pozitivní kontrolu ve formě DNA jedince stejného druhu. Protože v našem případě nebyl k dispozici vzorek samce mravenečníka velkého, použili jsme jedince ze stejného řádu chudozubých (Xenarthra) – lenochoda dvouprstého a mravenečníka čtyřprstého. Bylo zjištěno, že primery ověřené pro lenochoda dvouprstého je možno bez problémů použít u dalších zástupců řádu chudozubých.4
Metoda určení pohlaví pomocí amplifikace sekvence specifické pro pohlavní chromozom je velmi jednoduchá. Výsledek je třeba správně interpretovat. V případě objevení se proužku u amplifikace části SRY sekvence lze jednoznačně konstatovat, že jedinec mající SRY gen je s vysokou pravděpodobností samec. V případě neobjevení se proužku ale nelze jednoznačně říct, že jedinec je samice. Je třeba testovat další lokusy specifické pro pohlavní chromozomy.2 Samotný výskyt SRY genu také ještě nezaručuje správný vývoj samčího jedince. Y chromozomální materiál byl totiž detekován i u jedinců se samičím karyotypem, defekt v SRY genu velmi často vyvolá sex-reverzi a vývoj v samičího jedince.2,8,10,11
Závěr
Přes všechna úskalí spojená s touto metodou byl splněn stanovený cíl – bylo určeno, že oba testovaní mravenečníci velcí (Myrmecophaga tridactyla) jsou samci. Včasná identifikace pohlaví u mláděte mravenečníka čtyřprstého je také cenná pro jeho využití v chovatelských programech.
Poděkování:
Tato práce byla podporována výzkumným záměrem MZE0002716201. Poděkování patří i pracovníkům ZOO Olomouc za poskytnutí testovaných vzorků.
Literatura:
1. Griffiths R., Tiwari B. Primers for the differential amplification of the sex-determining region Y gene in a range of mammal species. Mol Ecol 1993;2:405-406.
2. Nur Semerci C., Lale Satiroglu-Tufan N., Turan S. et al. Detection of Y chromosomal material in patients with a 45,X karyotype by PCR method. Tohuku J Exp Med 2007;211:243-249.
3. Tiersch T. R., Mitchell M. J., Wachtel S. S. Studies on the phylogenetic conservation of the SRY gene. Hum Genet 1991;87:571-573.
4. Murata K., Masuda R. Gender determination of the Linne´s two-toed sloth (Choloepus didactylus) using SRY amplified from hair. J Vet Med Sci 1996;58(12):1157-1159.
5. Taberlet P., Mattock H., Dubois-Paganon C et al. Sexing free-ranging brown bears Ursus arctos using hairs found in the field. Mol Ecol 1993;2:399-403.
6. Yamamoto K., Tsubota T., Komatsu T. et al. Sex identification of Japanese black bear, Ursus thibetanus japonicus, by PCR based on amelogenin gene. J Vet Med Sci 2002;64(6):505-508.
7. Poulat F., de Santa Barbara P., Desclozeaux M. et al. The human testis determining factor SRY binds a nuclear factor containing PDZ protein interaction domains. J Biol Chem 1997;272(11):7167-7172.
8. Gimelli G., Gimelli S., Dimasi N. et al. Identification and molecular modelling of a novel familial mutation in the SRY gene implicated in the pure gonadal dysgenesis. Eur J Hum Genet 2007;15:76-80.
9. Kocher T. D., Thomas W. K., Meyer A. et al. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: Amplification and sequencing with conserved primers. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1989;86:6196-6200.
10. Domenice S., Nishi M. Y., Billerbeck A. E. C. et al. Molecular analysis of SRY gene in Brazilian 46, XX sex reversed patients: absence of SRY sequence in gonadal tissue. Med Sci Monit 2001;7(2):238-241.
11. Kothapalli K., Kirkness E., Pujar S. et al. Exclusion of candidate genes for canine SRY-negative XX sex reversal. J Heredity 2005;96(7):759-763.
Adresa autora:
Mgr. Blanka Robešová, CSc.
Výzkumný ústav veterinárního lékařství
Hudcova 70
621 00 Brno
e-mail: robesova@vri.cz
