M. SVOBODA,1 K. NECHVÁTALOVÁ,2 J. DRÁBEK,1 R. FICEK,1 J. KREJČÍ,2 Z. ŘEHÁKOVÁ,3 M. FALDYNA1,2
1 Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
2 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. Brno
3 Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany, Hradec Králové
Veterinářství 2008;58:700-703.
SOUHRN
Svoboda M., Nechvátalová K., Drábek J., Ficek R., Krejčí J., Řeháková Z., Faldyna M. Vliv nedostatku železa na imunitu sajících selat.
Cílem předkládané studie bylo zjistit, jaký vliv má nedostatek železa u sajících selat na buněčnou a humorální imunitu. U selat s nedostatkem železa byl experimentálně prokázán nižší počet celkových leukocytů, nižší relativní a absolutní počet neutrofilních granulocytů, menší podíl B-lymfocytů, větší podíl T-lymfocytů a NK buněk a snížená aktivita lymfocytů. Nedostatek železa se u selat neprojevil negativně v protilátkové odpovědi po vakcinaci tetanovým toxoidem.
SUMMARY
Svoboda M., Nechvátalová K., Drábek J., Ficek R., Krejčí J., Řeháková Z., Faldyna M. Influence of iron deficit on immunity of suckling piglets.
The aim of presented study was to find iron deficit in suckling piglets on both cell and humoral immunity. In piglets with iron deficit was experimentally proved lower number of whole leukocytes, lower relative and absolute number of neutrophil granulocytes, lower part of B-lymphocytes, higher proportion of t-lymphocytes and NK cells and lower activity of lymphocytes. Iron deficit in piglets did not proved negatively in antibody response after vaccination by tetan toxoid.
Úvod
Železo je významným prvkem a jeho dostatečný příjem je nezbytný pro zajištění normálních tělesných funkcí. Protože je železo základní součástí hemového barviva, jeho nedostatek má za následek snížení koncentrace hemoglobinu v krvi a vznik anémie.1,2 Anémie prasat je považována za vážný problém vyskytující se v chovech prasat. Selata mají v těle po narození omezenou zásobu železa (zhruba 50 mg Fe), z níž se převážná část nachází v játrech.3,4 Denní potřeba železa pro normální vývoj selete během prvních týdnů po narození činní asi 7 – 10 mg.3 Z mléka prasnice je však sele schopno získat maximálně 1 – 2 mg denně.5,6 Z toho vyplývá, že pokud není selatům v prvních dnech života aplikováno železo, vyvine se u nich během 10 – 14 dní po narození anémie.4,7 Nejobvyklejší metodou prevence vzniku anémie je aplikace dextranu železa dvou až třídenním selatům v dávce 200 mg i. m. Kromě vzniku anémie se nedostatek železa projevuje sníženou intenzitou růstu selat.2
Málo známou oblast představuje vliv nedostatku železa na imunitní funkce selat. Někteří autoři zjistili při nedostatku železa u selat nižší počet celkových leukocytů a nižší počet neutrofilních a eozinofilních granulocytů.2,8 Snížený počet neutrofilních granulocytů může zvyšovat vnímavost selat k infekcím. Dubanský et al. jistili výrazný deficit aktivity myeloperoxidázy u selat postižených deficitem železa.9 Myeloperoxidáza je železo obsahující enzym, který je obsažen v granulech neutrofilních granulocytů a který se účastní respiračního vzplanutí. Takto snížená imunita selat byla doprovázena přemnožením fakultativně patogenních mikroorganizmů v trávicím traktu. Následkem toho byly infikovány celé vrhy, včetně selat, která měla železa dostatek. Rovněž další autoři zjistili, že snížená imunita činí selata vnímavější k průjmovým onemocněním, zvláště v souvislosti s infekcí E. coli.10,11 Bylo také zjištěno, že deficit železa u prasat zhoršuje průběh onemocnění při napadení prasat parazitárním původcem Trichuris suis.12 Protože je v současné době k dispozici jen málo údajů týkajících se vlivu nedostatku železa na imunitní funkce selat, rozhodli jsme se prezentovat v tomto příspěvku výsledky našich experimentů.13,14 Cílem těchto experimentů bylo:
1. Zjistit vliv nedostatku železa na aktivitu lymfocytů a jejich zastoupení v krvi. Mezi lymfocyty patří T-lymfocyty zprostředkovávající regulační a cytotoxické funkce, B-lymfocyty produkující protilátky a NK buňky, které se účastní cytotoxických reakcí.
2. Zjistit vliv nedostatku železa na protilátkovou odpověď selat po vakcinaci tetanovým toxoidem. Pro produkci protilátek je nutná koordinovaná spolupráce buněk prezentujících antigen s T a b lymfocyty.
Materiál a metodika
Experiment č. 1: vliv nedostatku železa na buněčnou imunitu selat
Celkem bylo použito 20 selat ze dvou vrhů. Selata byla v každém vrhu rozdělena na dvě skupiny. Skupině deseti selat s deficitem železa nebylo aplikováno železo až do věku 21 dní. Ve věku 21 dnů bylo těmto selatům aplikováno železo ve formě dextranu železa v dávce 200 mg i. m. Druhé skupině selat bylo ve věku tří dnů aplikováno 200 mg Fe i. m. ve formě dextranu železa.
Selatům byla odebrána krev ve věku 21 dní z vena cava cranialis. Jako antikoagulant pro hematologické vyšetření byla použita EDTA. Heparin byl použit jako antikoagulant pro stanovení koncentrace železa v krevní plazmě a pro imunologické analýzy. Hematologické vyšetření zahrnovalo tyto parametry: koncentrace hemoglobinu, počet erytrocytů, hematokrit, počet bílých krvinek, diferenciální počet bílých krvinek.
Červené krvinky byly počítány v Bürkerově komůrce za použití Haymova roztoku, počet bílých krvinek za použití Türkova roztoku. Koncentrace hemoglobinu byla stanovena fotometricky za použití cyanmethemoglobinové metody. Hematokrit byl stanoven pomocí standardních kapilár a centrifugace v mikrohematokritové odstředivce. Dále byly vypočítány hodnoty MCV (střední objem erytrocytu), MCH (střední objem hemoglobinu) a MCHC (střední koncentrace hemoglobinu v erytrocytech). Diferenciální počet bílých krvinek byl stanoven pomocí světelné mikroskopie krevních nátěrů obarvených podle metod May-Grünwald a Giemsa-Romanowski. Koncentrace železa v krevní plazmě byla stanovena fotometricky měřením komplexu železa s ferrozinem.
Procentuální zastoupení subpopulací lymfocytů bylo stanoveno pomocí průtokové cytometrie. Základem metody je použití monoklonálních protilátek proti definovaným tzv. CD-antigenům, které jsou charakteristické pro vybrané subpopulace buněk. Tyto protilátky musí být označeny chemickými látkami zvanými fluorochromy, jejichž přítomnost je průtokový cytometr schopen detekovat.
Fagocytární aktivita leukocytů byla stanovena v plné krvi za použití mikrosférických hydrofilních partikulí (souprava MSHP). Pohlcení těchto partikulí neutrofilními granulocyty a monocyty bylo stanoveno pomocí modifikovaného testu dle Větvičky15: 50 μl suspenze MSHP partikulí bylo smícháno se 100 μl krve a inkubováno při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byl zhotoven krevní nátěr barvený podle metod May-Grünwald a Giemsa-Romanowski. V každém nátěru bylo hodnoceno 100 buněk a byl stanoven relativní počet bílých krvinek obsahujících alespoň tři pohlcené partikule (PFB) a fagocytární index (IFA = počet pohlcených partikulí/počet neutrofilních granulocytů a monocytů).
Aktivita lymfocytů byla stanovena v plné krvi pomocí testu blastické transformace. V testu jsou lymfocyty vystaveny účinku tzv. mitogenů, tj. látek, které indukují mitózu, která je spojená s tvorbou nových nukleových kyselin. Po dvou dnech inkubace se k buněčné kultuře přidá médium obsahující thymidin značený radioaktivním vodíkem, který je buňkami v mitóze zabudováván do nově tvořené nukleové kyseliny. Po dalším dni inkubace je pomocí tzv. kapalné scintilace detekována intenzita radioaktivního záření – silnější odpověď lymfocytů na účinek mitogenů je spojen s vyšší intenzitou. Výsledkem je stimulační index – poměr mezi aktivitou lymfocytů stimulovaných mitogenem a aktivitou lymfocytů, které stimulovány nebyly.
Experiment č. 2: Vliv nedostatku železa na protilátkovou odpověď po vakcinaci tetanovým toxoidem
Dvacet selat ze dvou vrhů bylo rozděleno do dvou skupin. Deseti selatům bylo ve věku tří dnů aplikováno 200 mg Fe i. m. ve formě dextranu železa. Deseti selatům nebylo železo podáno žádnou formou až do věku 21 dnů. Ve věku 21 dnů bylo těmto selatům aplikováno léčebně 200 mg Fe i. m. Selata byla odstavena ve věku 28 dnů. Vzorky na hematologické vyšetření byly odebrány ve věku 14, 21 a 35 dnů, ve stejném období byla selata vážena. Hematologické vyšetření zahrnovalo koncentraci hemoglobinu, hematokrit, počet červených krvinek, MCV, MCH, MCHC a koncentraci železa v krevní plazmě.
Všechna selata byla imunizována intramuskulárně 4 mg tetanového toxoidu ve věku 14 dnů. Reimunizace byla provedena za 21 dní po první aplikaci (tj. ve věku 35 dní). Detekce specifických antitetanových protilátek byla provedena pomocí modifikovaného ELISA testu.16 Výsledky byly statisticky zpracovány pomocí Mann-Whitney testu.
Výsledky
Výsledky jsou prezentovány jako průměry a jejich směrodatné odchylky.
Vliv nedostatku železa na buněčnou imunitu selat
Koncentrace hemoglobinu, hematokrit, počet červených krvinek, hodnoty MCV a MCH byly ve skupině bez podání železa významně nižší než ve skupině, kde bylo selatům podáno železo ve věku tří dnů. Dosažené tělesné hmotnosti byly významně nižší ve skupině selat, kterým nebylo aplikováno železo.
Celkový počet leukocytů byl významně nižší ve skupině selat bez dotace železa. Mezi oběma skupinami nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly ve fagocytární aktivitě krevních leukocytů.
Krev selat postižených deficitem železa obsahovala menší podíl B-lymfocytů a větší podíl T-lymfocytů a NK buněk. Dále byla zjištěna snížená aktivita lymfocytů v testu blastické transformace lymfocytů (graf 1, tab. 1).
graf 1, tab 1
Vliv nedostatku železa na protilátkovou odpověď po vakcinaci tetanovým toxoidem
Stejně jako v předešlém experimentu byla u selat, kterým nebylo aplikováno železo zjištěna anémie a snížená intenzita růstu. Dynamika protilátkové odpovědi IgM a IgG protilátek po aplikaci tetanového toxoidu byla podobná jak u skupiny selat s deficitem železa tak i u skupiny selat, kterým bylo ve věku 3 dnů aplikováno železo. V žádném období pokusu nebyly mezi oběma skupinami zjištěny statisticky významné rozdíly ve výšce titrů těchto protilátek.
graf 2, 3
Diskuse
Dosavadní studie zabývající se anémií selat z nedostatku železa byly zaměřeny hlavně na různé metody aplikace železa selatům. Malá pozornost byla zatím věnována vlivu nedostatku železa na imunitní funkce selat. V případě našeho experimentu byly u selat, kterým nebylo aplikováno železo, zjištěny ve věku 21 dnů příznaky anémie (bledé sliznice, bledá kůže po celém povrchu těla). Za anemický limit, tj. hranici, kdy jsou patrné příznaky anémie a dochází ke snížení intenzity růstu, je považována koncentrace hemoglobinu menší než 80g/l.2
V našem experimentu jsme prokázali rozdíly i v bílém krevním obrazu. U anemické skupiny selat byl zjištěn nižší počet celkových leukocytů a nižší relativní a absolutní počet neutrofilních granulocytů. Tato zjištění jsou ve shodě s ostatními autory.2,8 Navíc byl v našem experimentu zjištěn i nižší absolutní počet lymfocytů. Egeli prokázal u deficitních selat také nižší počet eosinofilních granulocytů.2. Toto zjištění nebylo naší studií potvrzeno. Ve fagocytární aktivitě jsme nezjistili statisticky významné rozdíly mezi skupinami.
Doposud nejsou v dostupné literatuře údaje o vlivu nedostatku železa na aktivitu lymfocytů u selat. Pomocí testu blastické transformace jsme v našem experimentu prokázali sníženou aktivitu lymfocytů u selat s nedostatkem železa. To je ve shodě s tím co bylo zaznamenáno u jiných živočišných druhů.17,18 Nižší počty leukocytů a zejména snížená aktivita lymfocytů mohou snižovat odolnost selat proti infekcím.
Dal by se také očekávat negativní dopad na intenzitu imunitní odpovědi na aplikaci antigenu. Toto se nám ale nepodařilo prokázat. Je obtížné určit přesně důvod proč nedostatek železa neovlivnil protilátkovou odpověď selat na tetanový toxoid. Protože jsme považovali stupeň anémie v deficitní skupině selat ve věku 21 dní za velmi výrazný, rozhodli jsme se naaplikovat selatům léčebně železo. Z toho důvodu měla selata nedostatek železa v době první imunizace (ve věku 14 dní) a jeden týden poté. V době reimunizace (21 dní po první imunizaci) došlo již v této skupině selat ke zvýšení všech ukazatelů červeného krevního obrazu a koncentrace železa v krevní plazmě a jejich hodnoty byly srovnatelné s kontrolní skupinou. Z toho vyplývá, že deficitem železa mohla být ovlivněna pouze primární imunitní odpověď organizmu.
Závěr
Výsledky naší studie, tj. nižší počet celkových leukocytů, nižší relativní a absolutní počet neutrofilních granulocytů, nižší absolutní počet leukocytů a snížená aktivita lymfocytů, jasně prokázaly sníženou buněčnou imunitu selat s nedostatkem železa. V naší studii nebyl prokázán negativní efekt nedostatku železa na protilátkovou odpověď selat po vakcinaci tetanovým toxoidem.
Tato práce vznikla za podpory projektu MSM 161700002 a MSM 6215712403 a projektu NAZV 1B44024. Autoři děkují paní Kudláčkové za technickou pomoc.
Literatura:
1. Heinritzi, K., Plonait, H. Blutkrankheiten. In: Lehrbuch der Scheinekrankheiten, 2nd ed., H. Plonait, K. Bickhardt, Parey Buchverlag, Berlin 1997;p.190.
2. Egeli, A. K., Framstad, T., Morberg, H. Clinical biochemistry, haematology and body weight in piglets. Acta Vet Scand 1998;39:381-393.
3. Venn, J. A. J., McCance R. A., Widdowson, E. M. Iron metabolism in piglet anemia. J Comp Path 1947;57:314-325.
4. Zimmermann, W. Auswirkungen diverser Anämieprohylaxeformen auf die Blutparameter der Saugferkel. Dtsch Tierärztl Wschr 1995;102:32-38.
5. Csapó, J. E. Protein, fats, vitamins and mineral concentration in porcine colostrum and milk from parturion to 60 days. Int Dair J 1995;6:881-902.
6. Kleinbeck, S., McGlone, J. Intensive indoor versus outdoor production systems: Genotype and supplemental iron effects on blood haemoglobin and selected immune measures in young pigs. J Anim Sci 1999;77:2384-2390.
7. Framstad, T. Sjaastad, O. Iron supplementation in piglets. Norsk Veterinaertidsskrift 1991;103:21-27.
8. Gainer, J. H., Guarnieri, J. Effects of poly I: C in porcine iron deficient neutropenia. Conell Vet 1985;75:454-465.
9. Dubansky, V., Zizlavsky, M., Drabek, J. Myeloperoxidase deficiency in piglets caused by insufficient iron supplementation (Myeloperoxidázová deficience selat vyvolaná nedostatečným přívodem železa po narození). Veterinářství 1997;47:205-209.
10. De Wayne, A., Boyd, B., Hal, H. A new prophylactic approach to reduction of piglet mortality. Med Vet Pract 1977;58:509-515.
11. Daykin, M. M., Griffiths, A. J., Towlerton, R. G. Evaluation of the parenteral iron requirement of early weaned pigs. Vet Rec 1982;110:535-537.
12. Pedersen, S., Saeed, I., Friis, H., Michaelsen, K. F. Effect of iron deficiency on Trichuris suis and Ascaris suum infections in pigs. Parasitol 2001;122:589-598.
13. Svoboda, M., Drábek, J., Krejčí, J., Řeháková, Z., Faldyna, M. Impairment of the peripheral lymphoid compartment in iron-deficient piglets. J Vet Med B 2004;51:231-237.
14. Svoboda, M., Nechvátalová, K., Krejčí, J., Drábek, J., Ficek, R., Faldyna, M. The absence of iron deficiency effect on the humoral immune response of piglets to tetanus toxoid. Vet Med 2007;52:179-185.
15. Větvička, V., Fornusek, L., Kopecek, J., Kaminkova, J., Kasparek, L., Vranova, M. Phagocytosis of human blood leukocytes: a simple micro-method. Immunol Lett 1982;5:97-100.
16. Faldyna, M., Pechova, A., Krejci, J. Chromium supplementation enhances antibody response to vaccination with tetanus toxoid in cattle. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 2003;50:326-331.
17. Omara, F. O., Blacley, B. R. The effects of iron-deficiency and iron overload on cell mediated-immunity in the mouse. Br J Nutr 1994;72:899-909.
18. Kuvbidila, S., Warrier, R. P., Baliga, B. S. An overview of the role of iron in T cell activation. J Trace Elem Exp Med 2003;16:219-225.
Adresa autora:
MVDr. Martin Svoboda, Ph.D.
Klinika chorob prasat
Veterinární a farmaceutická univerzita Brno
Palackého 1/3, 612 42 Brno
e-mail: svobodama@vfu.cz
