B. KOUDELA, Z. PAVLÍČKOVÁ
Ústav parazitologie Fakulty veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
Veterinářství 2004;54:352-356
SOUHRN
Koudela B., Pavlíčková Z. Vliv oplachování sítka na citlivost trávicí metody při vyšetřování vepřového masa na přítomnost larev trichinel. Veterinářství 2004;54:352-356.
Cílem práce bylo posouzení vlivu dodatečného oplachování sítka na citlivost trávicí metody při vyšetření vepřového masa na trichinelózu. Svalovinu bránice experimentálně infikovaných prasat jsme použili pro přidání nízkého (5 larev) a vysokého počtu larev (100 larev) Trichinella spiralis ke sledovaným vzorkům. Závaznou trávicí metodou (Vyšetření hromadných vzorků trávicí metodou s použitím magnetické míchačky, Metodický pokyn č. 14/2000, SVS ČR) jsme stanovovali počet larev detekovaných trichinel po oplachování a bez oplachování sítka. Naše výsledky ukázaly, že dodatečné oplachování sítka zvyšuje citlivost trávicí metody při vyšetření na trichinelózu.
SUMMARY
Koudela B., Pavlíčková Z. The influence of sieve rinsing on the efficancy evaluation of Trichinella detention method. Veterinářství 2004;54:352-356.
The objective of this study was to examine the influence of sieve rinsing at the conclusion of digestion method for Trichinella detection. The magnetic stirrer method for pooled sample digestion using pig diaphragm samples with low (5 larvae) or moderate(100 larvae) number of T. spiralis larvae was tested for effect of sieve rinsing on the method efficiency. Our results indicate that the pooled sample digestion method with rinsing of sieve at the conclusion of the digestion process is more sensitive than digestion method without this rinsing.
Trichinelóza je závažné parazitární onemocnění vázané na požití syrového nebo nedostatečně tepelně upraveného masa. Základní vyšetřovací metodou pro diagnostiku trichinelózy zvířat, jejichž maso je určeno k lidské spotřebě, je přímý průkaz larev trichinel. Dnes již klasickým vyšetřovacím postupem je metoda kompresní, která byla navržena v roce 1864 německým badatelem Rudolfem Virchowem. Principem vyšetřovacího postupu, který je často označován jako trichinoskopické (trichineloskopické) vyšetření, je roztlačení – komprese kousků svaloviny mezi skla a pozorování pod mikroskopem. Později bylo pro toto vyšetření vyvinuto tzv. kompresorium, které se skládá ze dvou silných skel rozdělených na 28 polí a opatřených šrouby pro vzájemné spojení a stlačení vzorků svaloviny mezi skly. Nevýhodou tohoto postupu je relativní pracnost, která komplikovala vyšetřování vepřového masa na jatkách, na kterých se poráží velké počty prasat. Kompresní metoda je v různých modifikacích používána do dnešních dnů a je také součástí oficiálních vyšetřovacích postupů.1,2-5
Koncem 70. let minulého století byla vyvinuta trávicí metoda, při které se vzorky svaloviny vystaví účinku uměle připravené žaludeční šťávy, která natráví svalová vlákna. Larvy trichinel se tak uvolní a následně se prokazují při prohlížení sedimentu pod mikroskopem. Tato metoda byla postupně rozvíjena a od původního postupu, při kterém bylo 20 g masa vystaveno účinku trávicí tekutiny po dobu 20 hodin,6 až po dnes používané postupy, při kterých je za podpory různých přístrojů tráveno100 g masa po dobu 30 minut. Trávicí metoda je při srovnání s metodou kompresní náročnější na přístrojové vybavení a čisté chemikálie. Je však citlivější a je schopna odhalit velmi slabé infekce trichinelami.
V srpnu 2000 byl zveřejněn Metodický návod č. 14/2000,5 vydaný Státní veterinární správou ČR. Tento metodický návod vychází z platných předpisů pro země Evropské unie2 a jsou v něm podrobně popsány závazné postupy vyšetřování masa na přítomnost larev trichinel. Celkem je zde popsáno sedm vyšetřovacích postupů (označených I – VII), ze kterých je šest založeno na principu trávicí metody (II – VII). Celkem u tří postupů trávicí metody se v průběhu vyšetřovacího postupu používá sítko s otvory 177 μm (III, IV a VI).2,5
Koncem roku 2000 byl publikován materiál Mezinárodní komise pro trichinelózu (International Commision on Trichinellosis, ICT), ve kterém jsou také formulována doporučení pro zlepšení trávicí metody. Jedním z doporučení je dodatečné oplachování sítka po přelití natráveného masa přes sítko.7 Cílem naší práce bylo posoudit vliv tohoto doporučení na citlivost trávicí metody provedené podle postupu VI. Vyšetření hromadných vzorků trávicí metodou s použitím magnetické míchačky.5
Materiál a metody
Infikované maso. Pro sledování vlivu doporučených změn na citlivost trávicí metody jsme použili svalovinu experimentálně infikovaných prasat. Jedno prase o hmotnosti 20 kg bylo experimentálně infikováno 20 000 larvami druhu Trichinella spiralis (číslo izolátu ISS No 1028) a druhé prase bylo infikováno dávkou 200 larev T. spiralis. Dva měsíce po infekci byla prasata utracena a pro další sledování jsme použili svaloviny bránic obou prasat.
Trávicí metoda. Jako standardní postup jsme používali metodu VI. Vyšetření hromadných vzorků trávicí metodou s použitím magnetické míchačky.5 Negativní vepřové bránice, které jsme nejprve vyšetřili trávicí metodou na přítomnost larev trichinel, jsme pomleli na masovém strojku s otvory o průměru 2 mm. V průběhu sledování jsme ke 100 g negativního masa přidávali svalovinu bránice infikovaných prasat se 100 larvami nebo 5 larvami. Počet larev jsme stanovili vyšetřením kousků masa bránice infikovaných prasat kompresní metodou, při které jsme se snažili volbou vhodných kousků masa a malým tlakem na skla kompresoria neporušit larvy T. spiralis. Maso bránice prasete infikovaného dávkou 20 000 larev sloužilo pro přidání 100 larev a bránice prasete infikovaného 200 larvami jsme použili pro přidávání 5 larev. Pomleté maso (100 g) s přidanými larvami jsme přemístili do třílitrové kádinky s 2 litry vyhřáté trávicí tekutiny (2 litry vody z vodovodu ohřáté na 46 – 48 °C, 16 ml 37% HCl, 10 g pepsinu v koncentraci 1 : 10 000 National Standard Formulary). Kádinku s vloženou magnetickou tyčinkou jsme zakryli aluminiovou fólií a postavili jsme ji na předehřátou desku magnetické míchačky (MM 7, Lavat Chotutice, Česká republika) a spustili jsme míchání. Před zahájením míchání jsme magnetickou míchačku seřídili tak, aby se teplota během jeho provozu udržela trvale na 44 – 46 °C. Po 30minutovém míchání jsme trávicí tekutinu přecedili přes sítko (177 μm, EuroSITEX, Příbram, Česká republika) umístěné v nálevce a shromáždili jsme filtrát do sedimentační baňky a poté jsme ponechali trávicí tekutinu 30 minut sedimentovat. Následně jsme odpustili 40 ml trávicí tekutiny do kalibrovaného válce. Po 10 minutách jsme odsáli 30 ml supernatantu. Zbývajících 10 ml sedimentu jsme vylili na Petriho misku a stanovili jsme počet larev T. spiralis.
Jako proměnnou jsme testovali vliv oplachování 100 ml vodovodní vody ohřáté na 44 – 46 °C (s oplachováním nebo bez oplachování) po přidání 5 larev nebo 100 larev. Postup trávicí metody jsem opakovali 10x pro každou z následujících modifikací:
A. 5 přidaných larev, sítko 177 μm, bez oplachování.
B. 5 přidaných larev, sítko 177 μm, s oplachováním.
C. 100 přidaných larev, sítko 177 μm, bez oplachování.
D. 100 přidaných larev, sítko 177 μm, s oplachováním.
Vliv oplachovaní jsme posuzovali srovnáním počtů získaných larev při jednotlivých modifikacích a vyjádřených v procentech (výtěžnost larev). Získané výsledky jsme statisticky vyhodnotily pomocí nepárového t- testu a analýzou variance (ANOVA).
Výsledky
Dodatečné oplachování sítka po přelití natráveného masa přes sítko se projevilo v hodnotách průměrných počtů získaných larev T. spiralis. Při vložení 5 larev bez dodatečného oplachování jsme detekovali průměrně 3,3 larvy a po dodatečném oplachování byl průměrný počet detekovaných larev 3,8. Při vložení 100 larev bez dodatečného oplachování jsme detekovali průměrně 71,1 larvy a po dodatečném oplachování byl průměrný počet detekovaných larev 81,9 larev. Při dalším vyhodnocení jsme zjistili statisticky významné rozdíly v počtu získaných larev mezi modifikacemi se 100 vloženými larvami T. spiralis.
Při srovnání výtěžností larev při jednotlivých modifikacích jsme zjistili statisticky významné rozdíly (p
Diskuse a závěr
Trávicí metody jsou závazným postupem pro detekci larev trichinel v mase zvířat určených k lidské spotřebě.2-5 Přestože jsou trávicí metody používány již řadu let, stále jsou publikovány práce, zabývající se zvýšením citlivosti a zmenšením pracnosti různých modifikací trávicích metod.7-13 Jedním z dílčích doporučení Mezinárodní komise pro trichinelózu (International Commision on Trichinellosis, ICT) na zlepšení parametrů trávicí metody pro detekci larev trichinel je dodatečné oplachování sítka po přelití natráveného masa přes sítko.7 V naší práci jsme se zaměřili na posouzení vlivu oplachování sítka na parametry trávicí metody s použitím magnetické míchačky5 a sledovali jsme počet detekovaných larev bez opláchnutí sítka a po opláchnutí sítka. Počty detekovaných larev jsme srovnali se známým počtem larev trichinel, které jsme přidali k masu na počátku postupu trávicí metody a vyjádřili je v procentech jako výtěžnost larev. Posuzovali jsme vliv oplachování sítka při nízkém počtu přidaných larev (5 larev) a při vysokém počtu přidaných larev (100 larev).
Z našich výsledků vyplývá, že dodatečné oplachování sítka zvyšuje počet detekovaných larev. Statisticky významné rozdíly jsme zjistili pouze při vysokém počtu přidaných larev. V případě nízkého počtu larev byl průměrný počet detekovaných larev po dodatečném opláchnutí sítka také vyšší, ale rozdíl nebyl statisticky významný. Také srovnání výtěžnosti larev po dodatečném oplachování sítka prokázalo signifikantní rozdíly pouze při vysokém počtu přidaných larev.
Vlivu vlastností sítka na parametry trávicí metody se věnoval Gamble.8 Posuzoval především vliv velikosti otvorů v sítku na výtěžnost larev. Známý počet natrávených larev v 50 ml vody nanášel na sítka s různou velikostí otvorů a sledoval počet larev zachycených na sítku po následném opláchnutí stejným objemem vody. Sledoval také vliv teploty suspenze a vliv morfologie larev na výtěžnost larev při použití sítek s různou velikostí otvorů. Z jeho výsledků vyplývá, že při nanášení larev suspendovaných ve vodě o teplotě 40 C na sítko o velikosti otvorů 180 μm je výtěžnost larev 63,1 ± 12,3 %. Výše zmíněné parametry a výsledky jsou rámcově srovnatelné s podmínkami našich experimentů. Jediným rozdílem je skutečnost, že v našich pokusech jsme na sítko nanášeli trávicí tekutinu s larvami. Naše podmínky experimentu, při kterých jsme použili maso prasat experimentálně infikovaných druhem Trichinella spiralis a na sítko jsme nanášeli trávicí tekutinu s larvami, tak více odpovídají skutečným podmínkám při záchytu larev trichinel trávicí metodou.
Naše výsledky potvrdily závažnost navrhovaného zlepšení postupu trávicí metody, a proto doporučujeme dodatečné oplachování sítka zařadit do postupu trávicí metody pro detekci larev trichinel.
Literatura:
1. Nöckler K., Pozio E. Voigt W. P.,Heidrich J. Detection of Trichinella infection in food animals.Vet Parasitol 2000;93:335–350.
2. European Economic Community. Council Directive 77/96/EEC of 21 December 1976 on the examination for trichinae (Trichinella spiralis) upon importation from third countries of fresh meat derived from domestic swine. Off J EC 1976;26:67-77.
3. European Economic Community. Council Directive 92/45/EEC of 16 June on health problems and questions of the communicable disease act in animals concerning hunted wildlife and the commercialization of game meat. Off J EC 1992;268:69-104.
4. Trichinellosis. In: Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. Office International des Epizooties, 2000:322-327.
5. Vyšetření na svalovce. Státní veterinární správa České republiky, Metodický návod č. 14/2000.
6. Kohler G., Ruitenberg E. J. Comparison of three methods for the detection of Trichinella spiralis infections in pigs by five European laboratories. Bull WHO 1974;50:1258-1263.
7. Gamble H. R., Bessonov A., Cuperlovic K. et al. Recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption. Vet Parasitol 2000;93:393–408.
8. Gamble H. R. Factors affecting the efficiency of pooled sample digestion for the recovery of Trichinella spiralis from muscle tissue. Int J Food Microbiol 1999;48:73-78.
9. Forbes L. B., Gajadhar A. A. A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and duality assurance system for use in testing pork and horse meat. J. Food Prot 1999;62:1308–1313.
10. Forbes L. B., Rajic A., Gajadhar A. A. Proficiency samples for quality assurance in Trichinella digestion tests. J Food Prot 1998;1396–1399.
11. Forbes L. B., Parker S., Scandrettt W. B. Comparison of a modified digestion assay with trichinoscopy for detection of Trichinella larva in Pork. J Food Prot 2003; 66:1043-1046.
12. Gamble H. R. . Detection of trichinellosis in pigs by artificial digestion and enzyme immunoassay. J. Food Prot 1996;59:295–298.
13. Gamble H.R. Sensitivity of artificial digestion and enzyme immunoassay methods of inspection for trichinae in pigs. J. Food. Prot 1998;61:339–343.
Adresa autora:
Doc. MVDr. Břetislav Koudela, CSc.
Ústav parazitologie FVL VFU Brno
Palackého 1 – 3
612 42 Brno
