MVDr. Jiří Nepeřený, MVDr. Vladimír Vrzal, CSc., MVDr. Josef Chumela
Bioveta, a. s., Ivanovice na Hané
Veterinářství 2007;57:624-628.
SOUHRN
Nepeřený J., Vrzal V., Chumela J. Ověření účinnosti vakcíny proti leptospiróze psů čelenžním testem.
Leptospiróza je zoonóza celosvětového rozšíření, způsobená serovary parazitárního rodu Leptospira. Leptospiry jsou udržovány v přírodních ohniscích prostřednictvím rezervoárových hostitelů, kteří slouží jako potenciální zdroj infekce pro člověka a vnímavá zvířata. Efektivní způsob zabránění onemocnění psů leptospirózou je imunoprofylaxe účinnými, zejména multivalentními vakcínami. Protektivní účinnost vůči každému sérovaru leptospir obsaženému ve vakcíně musí být prokázána čelenžním testem na psech před zaregistrováním a možností používání těchto imunobiologických preparátů v praxi. Cílem naší práce bylo ověřit a stanovit na psech vhodnou čelenžní dávku pro testy účinnosti na psech u následujících sérovarů leptospir: Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae a Leptospira canicola. Bylo prokázáno, že vakcína vyvolává protektivní imunitu vůči onemocnění leptospirózou.
SUMMARY
Nepeřený J., Vrzal V., Chumela J. Verification of vacccine efficacy against leptospirosis in dogs by a challenge test.
Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by serovars of parasitary genus Leptospira. Leptospiras persist in natural focuses by means of reservoir hosts that are a potential source of infection for both man and susceptible animals. Effective way of prevention from leptospirosis in dogs is the immunoprophylaxis that can be achieved by means of practical, chiefly multivalent vaccines. Protective efficiency against each serovar of leptospiras in a vaccine must be proved by a challenge test on dogs before registration and possibility of use of these immunobiological preparates in practice. The aim of our work was to verify and determine in dogs proper challenge dose for efficacy tests in dogs in the following serovars of leptospiras: Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae and Leptospira canicola. It has been proved that this vaccine causes protective immunity against leptospirosis.
Úvod
Leptospiróza je zoonóza s celosvětovým rozšířením a řadí se mezi onemocnění s přírodní ohniskovostí.1 Infekce člověka jsou velmi často vázané na profesionální nebo rekreační kontakt s rezervoárovými hostiteli, konkrétně s jejich močí nebo vodou, která je močí kontaminovaná. O způsobu nakažení člověka hodně napovídají historické, lidové názvy tohoto onemocnění: žňová neboli blaťácká horečka, polní horečka, nemoc pastevců prasat, nemoc sekáčů cukrové třtiny, horečka rýžových polí, nemoc banánových farem a podobně. Průběh onemocnění kolísá od lehkého po velmi těžký až smrtelný, především v důsledku selhání ledvin, jater a hemokoagulace. Původcem onemocnění je pohyblivá spirochéta rodu Leptospira, která se řadí do druhu Leptospira interrogans. Je známo přes 200 sérotypů, které se podle sérologické příbuznosti zařazují do 23 séroskupin.
Leptospiry jsou spirálně stočené pohyblivé tyčky se zahnutými konci a pravidelnými závity. Špatně se barví anilínovými barvivy, lze je vizualizovat stříbřením, imunofluorescencí, v zástinu nebo ve fázovém kontrastu. Rostou dobře v tekutých půdách obohacených sérem. Růst je prokazatelný po 1 – 2 týdenní kultivaci při teplotě 28 – 30 °C.
Na základě sérologické klasifikace byl rod Leptospira rozdělen do dvou základních druhů:
Leptospira interrogans – zahrnující všechny patogenní kmeny (patogenní pro zvířata a člověka)
Leptospira biflexa – zahrnující všechny nepatogenní kmeny (saprofytické kmeny)
Antigenně příbuzné sérovary obou druhů leptospir byly zařazeny do jednotlivých séroskupin.
Současné moderní poznatky především v oblasti molekulární biologie rozlišují jednotlivé skupiny leptospir na základě jejich genotypické příbuznosti a označují je jako tzv. genomospecies. Toto rozlišování je však poměrně složité a pracné a nelze je rutinně provádět v běžné diagnostické laboratoři. Proto se v klinické praxi stále ještě vychází z původní sérologické klasifikace.
V ohniscích se leptospiróza udržuje prostřednictvím rezervoárových hostitelů. To jsou volně žijící nebo domácí zvířata, u kterých onemocnění probíhá většinou enzooticky. Infekce u nich má obvykle chronický charakter. Leptospiry perzistují v renálních tubulech a vylučují se močí do zevního prostředí. Infekce se v populaci přenáší přímo, a to horizontálně i vertikálně. Při vertikálním přenosu pronikají leptospiry do zevního prostředí prostřednictvím plodových vod během zmetání nebo porodu. Leptospiróza u rezervoárových hostitelů má obvykle jen subklinický průběh onemocnění, ale přesto se rychle šíří na další jedince v populaci. U rezervoárových hostitelů je detekce původce zpravidla obtížná.
V průběhu času se mohou převažující sérovary u jednotlivých rezervoárových hostitelů postupně měnit. Děje se tak na základě zavádění moderních technologií a vlivem vakcinace.
Společnými projevy leptospiróz u člověka je náhlý začátek onemocnění, horečky, bolesti hlavy a zánět spojivek. Nejlehčí formy probíhají pod obrazem "chřipky" a často unikají pozornosti. Klinické onemocnění trvá několik dnů až týdnů; u neléčených případů i několik měsíců. Infekce mohou probíhat i asymptomaticky. Diagnózu potvrzuje vzestup titru protilátek při sérologickém vyšetření akutního a rekonvalescentního vzorku séra. Izolace leptospir je možná z krve (v 1. týdnu) eventuelně z mozkomíšního moku 4. – 10. den akutního stadia, nebo z moči po desátém dnu.
Pro infekci psů jsou v současné době nejdůležitější sérovary: 2-5
- Leptospira canicola
- Leptospira icterohaemorrhagiae
- Leptospira sejroe
- Leptospira grippotyphosa
- Leptospira bratislava
- Leptospira pomona
Příznaky onemocnění u psů závisí na imunitním stavu zvířete a virulenci a množství kmene leptospir. U mladých psů probíhá onemocnění mnohem závažněji. Příznaky mohou být velmi různorodé. Onemocnění zpravidla začíná vzestupem teploty na 39,5 – 40,5 °C. Objevuje se deprese, nechutenství, zvracení a dehydratace. Jsou pozorovány též příznaky poruch srážlivosti krve. Dále se může vyskytnout zánět spojivek, poruchy funkce ledvin a jater, poruchy dýchání, svalový tremor, průjmy až úhyn. U subakutních onemocnění pozorujeme nechutenství, dehydrataci a žíznivost. Objevuje se také nechuť k pohybu, a paraspinální přecitlivělost. U chronických případů se porucha ledvinných funkcí manifestuje hubnutím a zvýšeným pitím a močením, inapetencí a zvracením. Příznakem akutního či chronického selhání jaterních funkcí je ikterus (žloutenka) způsobená akutní nekrózou či chronickou fibrózou. Mohou být pozorovány i další související příznaky jako ascites či hepatoencefalopatie.6
Při použití antibiotik a vakcín se onemocnění stalo méně závažným a méně častým. V posledních dvou desetiletích se objevily informace o vzniku onemocnění jinými serovary, než které jsou typické a jsou součástí používaných vakcín. Nástup onemocnění je plíživý, s klinickými příznaky chronického ledvinového či jaterního selhání.
Materiál a metody
Efektivní způsob zabránění onemocnění psů leptospirózou je imunoprofylaxe účinnými, zejména multivalentními vakcínami.7,8
Protektivní účinnost vůči každému sérovaru leptospir obsaženému ve vakcíně musí být prokázána čelenžním testem na psech před zaregistrováním a možností používání těchto imunobiologických preparátů v praxi.9
O provedení a výsledcích čelenžních testů u psů pojednává v poslední době řada prací.2,7,8,10-12
Stěžejním a kritickým místem při provádění čelenžních pokusů je stanovení optimální čelenžní dávky jednotlivých sérovarů leptospir tak, aby bylo exaktně prokázáno, že daný vakcinační sérotyp leptospir vyvolává protektivní imunitu u vakcinovaných psů. Udržování čelenžních kmenů leptospir pro testy účinnosti vakcín proti leptospiróze psů bylo již dokumentováno.13
Cílem naší práce bylo ověřit a stanovit na psech vhodnou čelenžní dávku pro testy účinnosti na psech u následujících sérovarů leptospir: Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae a Leptospira canicola. Po stanovení vhodné čelenžní dávky byla provedena zkouška účinnosti vakcíny řady BIOCAN s obsahem leptospirového antigenu z produkce Biovety, a.s. Ivanovice na Hané (nástup imunity a délka imunity) dle podmínek European Pharmacopoeia (Ph. Eur.)9
Jako rozhodující pro stanovení vhodné čelenžní dávky leptospir byly vybrány patognomické příznaky infekce či onemocnění leptospirózou:
kultivační záchyt leptospir v krvi a moči v průběhu testační doby 28 dní (mikroskopické vyhodnocení)
kultivační záchyt leptospir v ledvinách, játrech a žlučovém měchýři (mikroskopické vyhodnocení) při pitvě 28. den po infekci, nebo v den úhynu
klinické příznaky onemocnění leptospirózou v průběhu testační doby - zejména:
- nastříknuté oční cévy (konjuktivitida)
- ikterus kůže (břicho, mezinoží) a sliznic (spojivka, sliznice dutiny ústní)
- nechutenství
- snížení hmotnosti
- celkové příznaky onemocnění (apatie, neupravená srst, bázlivost)
pitva - ikterus seróz – pobřišnice,
pohrudnice, serózy střev
- zvětšená játra
- křehká játra
- zvětšená slezina
- zvětšený žlučový měchýř
- zvětšená ledvina
Z hlediska těchto kritérií byla jako vhodná čelenžní dávka u testovaných sérovarů Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae a Leptospira canicola v souladu s našemi dřívějšími pracemi stanovena dávka minimálně na 1 x 106 leptospir/ml při čelenžní dávce 5 ml i. p. leptospirové kultury každého příslušného sérovaru.14
Při této čelenžní dávce lze vyhodnotit, zda testovaná vakcína vyvolává pozitivní imunoprofylaktický efekt vyhodnotitelný zejména:
- protektivní účinností vůči klinickým příznakům onemocnění
- příznivým účinkem proti infekci
- příznivým účinkem proti infekci močového ústrojí a vylučováním leptospir
V rámci hodnocení účinnosti leptospirových vakcín dle Ph. Eur. byly provedeny testace nástupu imunity a délky imunity.
A. Nástup imunity:
Při hodnocení nástupu imunity bylo v souladu s požadavky Ph. Eur. použito 60 štěňat plemene beagle stejného stáří a původu. Zvířata byla rozdělena na tři skupiny po 20 kusech pro zkoušku každého ze tří serovarů obsažených ve vakcíně. Vždy deset štěňat ve skupině bylo vakcinováno ve stáří osm týdnů jednou dávkou vakcíny BIOCAN DHPPi+L. Za čtyři týdny po primovakcinaci byla provedena revakcinace jednou dávkou vakcíny BIOCAN DHPPi+LR. Vždy deset štěňat sloužilo pak jako nevakcinované kontroly. Ve stáří 16 týdnů, tj. za čtyři týdny po revakcinaci byly všechny tři skupiny štěňat infikovány čerstvými kulturami leptospir v množství 5 . 106 zárodků v dávce 5 ml aplikovaných intraperitoneálně.
První skupina pokusných psů (deset ks vakcinovaných a deset ks kontrolních nevakcinovaných) byla čelenžována kmenem L. grippotyphosa, druhá skupina byla čelenžována kmenem L. canicola a třetí pokusná skupina byla čelenžována kmenem L. icterohaemorrhagiae.
V průběhu pokusu byl sledován a zaznamenáván zdravotní stav psů a v předepsaných intervalech byl prováděn odběr krve a moči k průkazu leptospir kultivací v živném médiu. Pokus byl ukončen 28. den po infekci utracením všech psů, posouzením patologickoanatomického obrazu a kultivací vzorku ledvin.
B. Délka trvání imunity
Při hodnocení délky trvání imunity bylo v souladu s požadavky Ph. Eur. použito 60 psů plemene Beagle stejného stáří a původu. Zvířata byla rozdělena na tři skupiny po 20 kusech pro zkoušku každého ze tří serovarů obsažených ve vakcíně. Vždy deset psů ve skupině bylo vakcinováno ve stáří asi tří měsíců jednou dávkou vakcíny BIOCAN DHPPi+L. Za čtyři týdny po primovakcinaci byla provedena revakcinace jednou dávkou vakcíny BIOCAN DHPPi+LR. Vždy deset psů sloužilo pak jako nevakcinované kontroly. Ve stáří asi 15 měsíců tj. za jeden rok po revakcinaci byly všechny tři skupiny infikovány čerstvými kulturami leptospir v množství 5 . 106 zárodků v dávce 5 ml aplikovaných intraperitoneálně.
První skupina pokusných psů (deset ks vakcinovaných a deset ks kontrolních nevakcinovaných) byla čelenžována kmenem L. grippotyphosa, druhá skupina byla čelenžována kmenem L. canicola a třetí pokusná skupina byla čelenžována kmenem L. icterohaemorrhagiae.
V průběhu pokusu byl sledován a zaznamenáván zdravotní stav psů a v předepsaných intervalech byl prováděn odběr krve a moči k průkazu leptospir kultivací v živném médiu. Pokus byl ukončen 28. den po infekci utracením všech psů, posouzením patologickoanatomického obrazu a kultivací vzorku ledvin.
Výsledky
Dosažené výsledky jsou názorně prezentovány v níže uvedených tabulkách.
Z dosažených prezentovaných výsledků vyplývá:
Za čtyři týdny po provedené revakcinaci, t.j. ve věku 16 týdnů byla vakcinovaná štěňata protektivně chráněna proti klinickým příznakům onemocnění a proti vylučování leptospir močí.
Z dosažených výsledků vyplývá:
Za jeden rok po provedené revakcinaci, t.j. ve věku 15 měsíců, byla vakcinovaná zvířata protektivně chráněna proti klinickým příznakům onemocnění a proti vylučování leptospir močí.
Diskuse
V experimentální studii byla prokázána protektivní účinnost vakcíny proti leptospiróze psů (komerční název Biocan L inj. ad us. vet. a Biocan LR inj. ad us. vet.) z produkce Biovety, a. s. Ivanovice na Hané, pomocí metody čelenžního testu v souladu s monografií Evropského lékopisu. Pro vyhodnocení účinnosti byly použity všechny předepsané a dostupné klinické a laboratorní metody.
Důležitým aspektem úspěšného provedení testu je výběr vhodného infekčního kmene leptospir a stanovení vhodné čelenžní dávky v provedených předexperimentálních studiích.
Laboratorní ověření protektivity vakcíny čelenžním testem je nejvíce náročnou, ale zcela objektivní zkouškou testace účinnosti vakcíny. Přestože klinická manifestace onemocnění u infikovaných nevakcinovaných zvířat má poměrně výrazný charakter, je pro vyhodnocení efektu vakcinace třeba vedle sledování klinických symptomů zařadit i izolaci původce z různého biologického materiálu pokusných zvířat a dostupné serologické metody.
Nejnáročnějšími experimenty (čelenžními testy) byly potvrzeny stěžejní údaje v imunoprofylaktickém programu vakcinace proti leptospiróze vakcínami řady Biocan z produkce Biovety, a. s., Ivanovice na Hané. Solidní protektivní imunity u primovakcinovaných štěňat je dosaženo za čtyři týdny po provedené revakcinaci a tímto způsobem vakcinovaná štěňata jsou protektivně chráněna minimálně jeden rok. Pak následují pravidelné roční revakcinace, u leptospirózy je nutná pravidelná jednoroční revakcinace pro zachování trvalé protektivní imunity vůči leptospiróze. Dosažené výsledky jsou v souladu s příbalovou informací u vakcín Biocan L i Biocan LR. Námi dosažené výsledky jsou i v souladu s údaji uváděnými ve světové literatuře,8 o jednoročním trvání imunity po vakcinaci psů celobuněčnými vakcínami.
Závěr
Po primovakcinaci štěňat vakcínami řady Biocan (Biocan L, Biocan LR) z produkce Biovety, a.s., Ivanovice na Hané vzniká solidní protektivní imunita za čtyři týdny po revakcinaci. Tato protektivní imunita trvá minimálně jeden rok. Ověření bylo provedeno v náročných čelenžních experimentech na pokusných psech, čelenží všemi patogenními sérovary leptospir, proti kterým je vakcína určena. Za použití dalších dostupných laboratorních metod (zejména kultivační záchyt leptospir z různých biologických materiálů získaných in vivo či post mortem se prokázalo, že vedle protektivního klinického efektu se u vakcinovaných zvířat oproti kontrolám příznivě projevil i efekt proti infekci včetně příznivého efektu proti infekci močového ústrojí a vylučování leptospir močí.
Vakcinace psů proti leptospiróze má tedy své významné opodstatnění v prevenci této nebezpečné nákazy u zvířat, včetně nepřímé ochrany člověka.
Literatura:
1. Langston E. E., Heuter K. J. Leptospirosis A re-emerging zoonotic disease. Vet Clin Small Anim 2003;33:791-807.
2. Schreiber P., Martin V., Najbar W., Sanquer A., Gueguen S., Lebreux B. Prevention of a severe disease by a leptospira vaccination with a multivalent vaccine. Revue Méd Vét 2005;156:8-9, 427-432.
3. Scanziani E., Origgi F., Giusti A. M., Iacchia G., Vasino A., Pirovano G., Scarpa P., Tagliabue S. Serological survey of leptospiral infection in kennelled dogs in Italy. J Small Anim Pract April 2002;43:154-157.
4. Adin C. A., Cowgill L. D. Treatment and outcome of dogs with leptospirosis: 36 cases (1990 – 1998). JAVMA 2000;216(3):371-375.
5. Boutilier P., Carr A., Shulman R. L. Leptospirosis in dogs: A serological survey and case series 1996 to 2001. Vet Therapeutics 2003;4(4):387-395.
6. Svoboda M., Pospíšil Z. Leptospiróza. In: Infekční nemoci psa a kočky, Brno 1996;295-306.
7. Schreiber P., Martin V., Najbar W., Sanguer A., Gueguen S., Lebreux B. Prevention of renal infection and urinary shedding in dogs by a leptospira vaccination. Veterinary Microbiology 2005;108:113-118.
8. Klaasen H. L. B. M., Molkenboer M. J. C. H., Vrijenhoek M. P., Kaashoek M. J. Duration of immunity in dogs vaccinated against leptospirosis with a bivalent inactivated vaccine. Veterinary Microbiology 2003;95:121-132.
9. European Pharmacopoeia, 0447, 01/2005, Canine leptospirosis vaccine (inactivated).
10. André-Fontaine G., Branger C., Gray A. W., Klaasen H. L. B. M. Comparison of the efficacy of three commercial bacterins in preventing canine leptospirosis. Veterinary Record 2003;153:165-169.
11. Greenlee J. J., Bolin C. A., Alt D. P., Cheville N. F., Andreasen C. B. Clinical and pathological comparison of acute leptospirosis in dogs caused by two strains of Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa. AJVR 2004;65(8):1100-1107.
12. Greenlee J. J., Alt D. P., Bolin C. A., Zuerner R. I., Andreasen C. B. Experimental canine leptospirosis caused by Leptospira interrogans serovar pomona and Bratislava. AJVR 2005;66(10):1816-1822.
13. Reed N. E., Varney W. C., Goddard R. D., Wyeth P. J. The Maintenance of Challenge Strains Used in the Potency Test for Canine Leptospira Vaccines. Biologicals 2000;28:25-28.
15. Vrzal V., Chumela J., Nepeřený J. Efficacy testing of vaccines against canine leptospirosis using a challenge test on target animal species. International Veterinary Vaccines and Diagnostic Conference 2006; Oslo, Norway, Sborník.
Adresa autora:
MVDr. Jiří Nepeřený
Bioveta, a.s.
683 23 Ivanovice na Hané
nepereny.jiri@Bioveta.cz
