J. NEPEŘENÝ, J. CHUMELA, J. TUHÁČKOVÁ, V. VRZAL
Bioveta, a. s. Ivanovice na Hané
Veterinářství 2007;57:213-217.
SOUHRN
Nepeřený J., Chumela J., Tuháčková J., Vrzal V. Ověření účinnosti vakcíny proti Lymeské borrelióze psů čelenžním testem.
Účinnost vakcíny proti Lymeské borrelióze psů (Biocan B inj. a. u. vet.) byla ověřena čelenžním testem pomocí infikovaných klíšťat a dostupnými serologickými metodami. Po vakcinaci vznikají u psů vysoké hladiny specifických protektivních OspA protilátek. U vakcinovaných psů nebyly po čelenži v biologických vzorcích kultivačně prokázány borrelie, u kontrolních nevakcinovaných psů byly borrelie diagnostikovány. Bylo prokázáno, že vakcína vyvolává protektivní imunitu vůči onemocnění Lymeskou borreliózou.
SUMMARY
Nepeřený J., Chumela J., Tuháčková J., Vrzal V. Verification of vaccine effectivity against Lyme borreliosis in dogs by challenge test.
Efficacy of a vaccine against Lyme borreliosis in dogs (Biocan B inj. a. u. vet.) was verified by the challenge test by means of infected ticks and accessible serological methods. In dogs rise high levels of specific protective OspA antibodies after vaccination. In vaccinated dogs were not proved borrelia after challenge in biologic samples, in controlled group of non-vaccinated dogs were borrelia diagnosed. It has been proved that this vaccine causes protective immunity against Lyme borreliosis.
Úvod
Pokroky ve virologii, mikrobiologii, patogenezi, imunologii, genetice a molekulární biologii nákaz vedou k rychlému vývoji nových typů vakcín. Cílem nových technologií je vyvinout bezpečnější a účinnější vakcíny.1,2 Příkladem může být vakcína proti Lymeské borrelióze psů. Onemocnění je vyvolané skupinou spirochet souhrnně označovaných jako Borrelia burgdorferi sensu lato. Tato skupina mikroorganismů je tvořena třemi blízce příbuznými subspeciemi: Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. Zatímco B. burgdorferi sensu stricto je příčinou prakticky všech onemocnění Lymeskou borreliózou na severoamerickém kontinentu, v Evropě převládají B. afzelii a B. garinii).3
B. burgdorferi sensu lato má bohatou antigenní strukturu. Povrchové antigeny (OspA, OspB) jsou variabilní a mají plazmidový původ. Dalším imunogenním proteinem je bičíkový flagelin p41, který však má nespecifické epitopy. Antigen p60 (obecný antigen) je společný pro řadu jiných bakterií. Povrchový OspC antigen je hlavním imunogenem v časné protilátkové odpovědi, p100 antigen pak v pozdní fázi imunity. Intracelulární perzistence borrelií byla prokázána in vitro i in vivo, a to i po léčbě antibiotiky. Intracelulárně perzistující borrelie se nedělí. Borrelia burgdorferi tvoří extracelulární membránové vezikuly, které obsahují povrchové antigeny Osp A, B, C, D a plazmidovou DNA.
Rezervoárem (zdrojem) onemocnění jsou drobní hlodavci, ptáci, ale i velcí savci. Nejčastějším přenašečem onemocnění je v našich zeměpisných podmínkách klíště obecné (Ixodes ricinus) a jeho vývojová stadia.
Lymeská nemoc je široce rozšířené onemocnění s charakterem přírodně ohniskové nákazy. V endemických oblastech udávají některé studie až 75 % pozitivních psů. Odhaduje se, že incidence výskytu této nemoci je u psů 10x vyšší než u člověka. Vzhledem k přenosu tohoto onemocnění je důležitým ukazatelem promořenost klíšťat. Ta může dosahovat až 20 % i více procent.
Místa s častým nálezem infikovaných klíšťat jsou např. Praha, Brno, jižní Morava atd. Rizikovými oblastmi jsou listnaté nebo smíšené lesy, lesoparky, zejména jejich travnaté a křovinaté části. Infikovaná klíšťata často nacházíme i v městských parcích.
Klíště sáním na infikovaných hostitelích získává borrelii, která se množí v jeho střevní stěně, kde infekce zůstává lokalizována, nebo dochází ke generalizovanému rozsevu do ostatních tkání. Během sání klíštěte borrelie pronikají jednak do střevního lumenu, jednak jsou hemolymfou zaneseny do slinných žláz. Riziko vzniku infekce stoupá po 24 hodinách sání klíštěte. Čím delší sání, tím je vyšší riziko.
Projevy tohoto onemocnění jsou značně variabilní a projeví se v rozmezí několika týdnů až měsíců po infekci. Mezi časté projevy borreliózy patří otoky a bolestivost kloubů, bolestivost svalů, z toho vyplývající neochota k pohybu, kulhání, přecitlivělost, často i vysoká teplota (i přes 40,5 oC), apatie, nechutenství. Někdy jsou příznaky tak mírné, že jim majitelé nepřikládají význam.
Vzhledem k málo typickým a značně různorodým projevům tohoto onemocnění je nutno provést důkladné klinické vyšetření pacienta a při podezření na borreliózu provést další vyšetření.
Stanovení imunoglobulinů IgM a IgG. O probíhající infekci svědčí zvýšení hladiny IgM. Vyšetření musí být provedeno dvakrát po sobě v intervalech minimálně 14 dnů (lépe 3. až 4. týdnů). Změny v hladinách obou imunoglobulinů spolu s přítomnými klinickými příznaky mohou diagnózu potvrdit.
Izolace původce z biologického materiálu. Standardně se pro kultivaci borrelií používají vysoce obohacené půdy, které umožňují růst nutričně velmi náročným bakteriím.
Přímý průkaz Borrelia burgdorferi identifikací specifické DNA v biologickém materiálu . Zavedení molekulárně genetických metod do diagnostiky původců infekčních nemocí v devadesátých letech minulého století zásadním způsobem pomohlo i při průkazu původce Lymeské borreliózy.
Průkaz přítomnosti VlsE protilátek pomocí komerčního setu Snap® 3Dx Test Heartworm, E.canis, Lyme.
Borrelióze lze u psů a koček předejít včasnou vakcinací. Vzhledem k tomu, že ani po prodělaném onemocnění není tělo chráněno proti další nákaze, je imunizace vedle zabránění přisátí klíšťat (repelentní přípravky) a jejich včasné odstranění, jedinou možnou prevencí onemocnění borreliózou.4,5
Nejprůkaznější metodou ověření účinnosti dané vakcíny je provedení čelenžního testu, kdy vakcinovaná a nevakcinovaná (kontrolní) zvířata jsou infikována způsobem co nejvíce se blížícím přirozené infekci. V práci prezentujeme princip a výsledky originálního ověření účinnosti vakcíny proti Lymeské borrelióze psů čelenžním testem pomocí infikovaných klíšťat.
Materiál a metody
Vakcína Biocan B inj. ad us. vet., vyráběná společností Bioveta, a. s., Ivanovice na Hané byla aplikována cílovým zvířatům – psům, rozděleným do dvou skupin na zvířata nevakcinovaná (kontrolní) a zvířata vakcinovaná. Za pomocí speciálních fixačních komůrek připevněných k trupu psů byla provedena infekce přirozenými nosiči onemocnění – klíšťaty, u kterých byl předem prokázán stupeň infekce borreliózou.
Nakaženost klíšťat byla potvrzena jednak přítomností specifické DNA v náhodně vybraných jedincích z celého množství sebraných klíšťat a rovněž mikroskopicky v trávicím aparátu těchto vybraných klíšťat.
Na každého pokusného psa bylo pro infekci použito 50 ks klíšťat z volného přírodního sběru z oblasti jižních Čech s přesně stanoveným poměrem samiček a samců, s předem zjištěnou infektivitou klíšťat borreliemi ve výši 28 %. Bylo dosaženo 92,2 % přisátí klíšťat na pokusné psy pomocí speciálních fixačních komůrek. Tím byla zajištěna vysoká možnost a pravděpodobnost infekce pokusných psů borreliemi prostřednictvím přirozeného vektora – klíštěte obecného (Ixodes ricinus).
Výsledky
Během pozorovací doby tří měsíců po čelenži nebyly u vakcinovaných ani kontrolních psů pozorovány klinické příznaky onemocnění Lymeskou borreliózou. Tato skutečnost může být způsobena relativně krátkou dobou pozorování psů po čelenži s ohledem na charakter onemocnění (nevýrazné symptomy onemocnění, chronická forma nemoci).
Detekce borrelií kultivační metodou ve speciálním růstovém BSK-H médiu byla prokázána jen u kontrolních nevakcinovaných psů. Borrelie byly detekovány jak z kožních biopsií získaných z pokusných psů in vivo, tak i ze vzorků získaných post-mortem (borrelie byly prokázány v synoviální membráně, mízní uzlině a svalovině kontrolních nevakcinovaných psů).
Chráněnost vakcinovaných psů proti čelenži borreliózou byla také prokázána nepřímo pomocí serologických testů. U pokusných vakcinovaných psů byly prokázány vysoké hladiny IgG protilátek proti borrelióze a vysoké hladiny specifických protilátek detekovaných speciální ELISA KELA metodou. Za nejdůležitější serologické stanovení lze považovat detekci vysokého titru specifických OspA protilátek, které jsou všeobecně považovány za nejdůležitější v prevenci infekce borreliózou.6 -8 Dosažené vyhovující výsledky tvorby OspA protilátek u vakcinovaných psů jsou v souladu s prokázaným proteinem OspA v obou výrobních kmenech borrelií používaných pro výrobu Biocanu B inj. ad us. vet. – Vakcíny proti Lymeské borrelióze psů z produkce Biovety, a. s. Ivanovice na Hané.
Diskuse
V experimentální studii provedené pracovníky společnosti Bioveta, a. s. byla prokázána účinnost vakcíny proti Lymeské borrelióze psů (komerční název Biocan B inj. ad us. vet.) pomocí originální metody čelenžního testu prostřednictvím infikovaných klíšťat. Obecně je metoda čelenže považována za nejprůkaznější test ke stanovení účinnosti přípravku. Pro vyhodnocení účinnosti byly použity všechny dostupné klinické a laboratorní metody.
Metoda infekce prostřednictvím infikovaných klíšťat je přirozenou cestou infekce, na rozdíl od jiných publikovaných způsobů infekce (injekční intradermální aplikace kultury borrelií). Již v dřívějších publikovaných pracích se potvrdilo,9 že infikovaná klíšťata sající na zvířatech imunizovaných vakcínou s obsahem OspA proteinu ztrácí svou infekciozitu. To svědčí o následném principu vakcinace: borrelie jsou inaktivovány zejména již v organismu klíštěte po napití krve imunizovaného zvířete s obsahem OspA protilátek před vstupem do hostitelského organismu a je tak zabráněno přestupu borrelií z infikovaného klíštěte do hostitelského organismu (část borrelií může být inaktivována krátce po vstupu do hostitelského organismu ještě před antigenní variací a útlumem exprese antigenu OspA). V současné době se OspA protilátky stanovují pouze semikvantitativně, není dostupná komerční souprava ke stanovení jejich přesné hladiny. Není také prozatím stanovena korelace mezi titrem OspA protilátek a protektivitou vakcinovaných zvířat vůči onemocnění Lymeskou borreliózou. Z výše uvedeného principu vzniku protektivity po vakcinaci vůči borrelióze je i laboratorní ověření protektivity čelenžní zkouškou pomocí infikovaných klíšťat objektivní zkouškou testace účinnosti vakcíny. Protože klinická manifestace onemocnění postihuje pouze část infikovaných zvířat a nemá výrazný charakter, pro vyhodnocení efektu vakcinace je třeba vedle sledování klinických symptomů zařadit i izolaci původce z pokusných zvířat a dostupné serologické metody.
Závěr
Po vakcinaci vakcínou proti Lymeské borrelióze psů (Biocan B inj. ad us. vet.) vznikají u psů vysoké hladiny specifických protektivních OspA protilátek. Chráněnost vakcinovaných psů byla prokázána za použití originálního čelenžního testu pomocí infikovaných klíšťat. U vakcinovaných psů nebyly v bioptických vzorcích získaných in vivo nebo post mortem kultivačně prokázány borrelie, u kontrolních nevakcinovaných psů byly borrelie prokázány ve vzorcích bioptického materiálu jak v průběhu pokusu u živých zvířat, tak v různých tkáních po provedené pitvě zvířat. Vakcinace proti Lymeské borrelióze má své významné opodstatnění v prevenci nebezpečného infekčního onemocnění psů – Lymeské borreliózy.
Literatura:
1. Roth J. A., Henderson L. M. New Technology for Improved Vaccine Safety and Efficacy. Immunology 2001;3(17):585-597.
2. Spickler A. R., Roth J. A. Adjuvants in Veterinary Vaccines: Modes of Action and Adverse Effects. J Vet Intern Med 2003;17:273-281.
3. Littman M. P. Canine borreliosis. Vet Clin Small Anim 2003;33:827-862.
4. Wiedemann C., Milward F. Efficacy and safety studies with a new vaccine against Lyme Borreliosis in dogs. Sonderdruck aus Tierärztliche Umschau 1999(5):242-249.
5. Wurzler G. M. D. Current Vaccination Strategies in Puppies and Kittens. Vet Clin Small Anim 2005;36:607-640.
6. Levy S. A., Clark K. K. Glickman L. T. Infection Rates in Dogs Vaccinated and not Vaccinated with an OspA Borrelia burgdorferi Vaccine in a Lyme Disease – Endemic Area of Connecticut. Inter J Appl Res Vet Med 2005;(3):1-5.
7. Fikrig E., Narasimhan S. Borrelia burgdorferi – Traveling incognito? Microbes and Infection. 2006;8:1390-1399.
8. Crowe B. A. Development of a Novel OspA-based Combination Vaccine to Prevent Lyme Borreliosis. 8th International Conference on Tickborne Diseases, Sept. 11-15. 2005, Vienna, Austria.
9. Fikrig E., Telford S. R., Barthold S. W., Kantor F. S., Spielman A., Flavell R. A. Elimination of Borrelia burgdorferi from vector ticks feeding on OspA-immunized mice. Proc Natl Acad Sci 1992;89:5418-5421.
Adresa autora:
MVDr. Jiří Nepeřený
Komenského 212
683 21 Ivanovice na Hané
e-mail: nepereny.jiri@bioveta.cz
