První nález oocyst morfometricky podobných druhům Cryptosporidium muris a C. andersoni u kočky

I. PAVLÁSEK Státní veterinární ústav, Praha Veterinářství 2005;55:480-483.

SOUHRN
V České republice, v parazitologické laboratoři Státního veterinárního ústavu v Praze, byly
při rutinním koprologickém vyšetřování kočky (plemeno britská krátkosrstá kočka) nalezeny vůbec poprvé oocysty Cryptosporidium podobné druhům C. muris, C. andersoni, ale i C. galli. Nejčastější velikost oocyst byla 8,0 x 4,8 µm, průměrný index oocyst délka/šířka byl 1,6, šířka/délka 0,6. V příspěvku je popsána morfologická charakteristika oocyst. Experimentálním přenosem izolátem oocyst (KB-1/04) od spontánně nakažené kočky byla potvrzena vnímavost kryptosporidie pro 35 a 40denní laboratorní myši v dávce 5.105 oocyst/myš. Prepatentní perioda byla 11 dnů, patentní perioda trvala 42 dny.

SUMMARY
In the Czech Republic, in the laboratory of parasitology of the State Veterinary Institute, Prague, during routine coprological examination of a cat (the race was British short-hair cat) we have found for the first time Cryptosporidium oocysts similar to C. muris, C. andersoni and also C. galli. The measured size of oocysts was mostly 8.0 x 4.8 µm, the mean index of oocysts in length/width was 1.6, and width/length was 0.6. Morphological characteristics of oocysts is described in this paper. Experimental transmission of isolated oocysts (KB – 1/04) from spontaneously infected cat has proven susceptibility for 35 and 40-day laboratory mice, with the dose 5.105 oocysts/mouse. Prepatent period was 11 days, the patent period lasted 42 days.

Úvod
Počátek intenzivního výzkumu Cryptosporidium ve veterinární medicíně spadá do roku 1971 v souvislosti se zjištěním prvoka u 8měsíční jalovičky (v USA) s průjmovým onemocněním1 a v humánní medicíně v roce 19762,3 s prvními nálezy kryptosporidií u člověka. V Československu byl výskyt Cryptosporidium spp. vůbec poprvé zaregistrován u dvou nuceně odporažených 14denních býčků v jižních Čechách v roce 1979.4 V období let 1907 – 1986 bylo různými autory popsáno celkem 20 druhů kryptospoiridií, z toho deset druhů u savců.5 Na základě poznatků z úspěšných křížových experimentálních přenosů uskutečněných mnoha autory koncem 70. a 80. let minulého století vznikla určitá představa o existenci pouze jednoho druhu kryptosporidie, který se nachází v životním prostředí mezi různými hostiteli.6 V současné době ale studium genotypů Cryptosporidium podporuje ve velké míře spíše samostatnost jednotlivých druhů pro tyto parazity, i když se připouští, že příbuzní hostitelé mohou mít často i zpříbuzněné druhy kryptosporidií, na které se v procesu fylogeneze postupně adaptovaly. Proto i nadále zůstává druhové určení problematické a to především u těch kryptosporidií vyznačujících se širokým hostitelským spektrem.
Studium kryptosporidií je předmětem zvýšeného zájmu mnoha vědeckovýzkumných pracovišť u nás i v zahraničí, takže nových poznatků o těchto protozoích neustále enormně přibývá. S potěšením můžeme konstatovat, že přibývá i požadavků praktických veterinárních lékařů provádět v diagnostických laboratořích cílená parazitologická vyšetření v zasílaném materiálu se zvláštním zaměřením právě na přítomnost kryptosporidií, což zpětně velmi pozitivně přispívá také k rozšíření našich poznatků o výskytu spontánních kryptosporidiových nákaz u různých druhů hostitelů v našich podmínkách.
Vzhledem k tomu, že některé druhy těchto prvoků mají zoonotický charakter je v posledních letech věnována značná pozornost zejména jejich hostitelské specifitě a tím také možnosti vzájemného přenosu nákaz mezi různými hostiteli v životním prostředí. Využití molekulárně biologických metod při studiu této velmi složité problematiky umožňuje blíže charakterizovat nejen jednotlivé izoláty kryptosporidií, ale současně přispívá také k objektivnějšímu vyhodnocení epizootologické a epidemiologické situace kryptosporidiózy. Interpretace výsledků dosažených z genotypových analýz, ve většině případů oocyst kryptosporidií, je však často velmi komplikovaná a taxonomické určení řady druhů zůstává nejasné. Vzrůstá proto význam mnohem užšího propojení a vyhodnocování výsledků získaných z tradičního pojetí studia kryptosporidií (životní cyklus, morfometrická charakteristika endogenních vývojových stadií, přenosové pokusy apod.) s metodami molekulárních analýz těchto prvoků.
Střevní forma kryptosporidiové infekce byla u kočky domácí (Felis domestica) poprvé diagnostikována Isekim v roce 1979 v Japonsku.7 Autor pojmenoval původce C. felis, popsal jednotlivá vývojová stadia životního cyklu a stručně zhodnotil i jeho patogenitu. Poprvé podal důkaz o vylučování oocyst prvoka trusem infikovaných koček. Připustil, že C. felis připomíná C. parvum, C. meleagridis a C. wrairi avšak tím, že se mu nedařilo přenést infekci na sedmitýdenní myši a na morčata byl přesvědčen o hostitelské specifitě tohoto kočičího druhu kryptosporidie. Publikace některých autorů z let 1983-19858-10 upozorňují, že koťata byla zdrojem kryptosporidiové infekce dětí a dospělého muže.
V Československu byla poprvé spontánní kryptosporidióza zjištěna u dvou 50denních koťat pocházejících z jednoho vrhu v roce 1985.11 Jestliže v minulosti byly kočičí střevní kryptosporidie považovány za druh C. parvum (obr. 1), potom morfologické a genetické studie oocyst kryptosporidií od domácích koček prokázaly určité odlišnosti od druhu C. parvum a znamenaly tak ustanovení samostatného a v současné době platného druhu – C. felis.12

Tento druh byl detekován kromě koček např. také u skotu na jedné farmě na severu Polska13, ale také u pacientů, většinou s poruchami imunitního systému.14
Kromě střevních kryptosporidiových infekcí jejímž typickým původcem je druh C. parvum15 vyskytují se u savců také žaludeční (abomasální) formy nákazy, o nichž je k dispozici, na rozdíl od střevních, prozatím jen velmi málo informací. Typickým a prvním popsaným druhem tohoto typu kryptosporidie je C. muris,16 jakožto prvok infikující žaludeční žlázy, zejména hlodavců. V České republice byl zaznamenán první výskyt kryptosporidie, v té době a vzhledem k úspěšnému přenosu na laboratorní myši považované za druh C. muris, u jednoho plemenného býka v září 199317 s lokalizací endogenních vývojových stadií v lumenu fundálních žlázek slezu. V roce 2018 byl popsán nový druh – C. andersoni odpovědný za slezovou (abomasální) kryptosporidiózu u skotu. Postupně jsme v parazitologické laboratoři Státního veterinárního ústavu diagnostikovali žaludeční kryptosporidiózu s nálezy endogenních vývojových stadií v žaludečních žlázách nebo s průkazem typických „velkých“ oocyst při koprologických vyšetřeních u křečka roborovského, velblouda dvouhrbého, kozy domácí,19 divoce žijících myší domácích, potkanů a zubra.
Cílem tohoto krátkého sdělení je informace o nálezech „velkých“ oocyst také v exkrementech kočky, jakožto zcela nového hostitele tohoto typu Cryptosporidium. (Zcela novým hostitelem, v jehož exkrementech jsme nalezli „velké“ oocysty Crypotosporidium, je kočka.)

Původ izolátu oocyst a stručná charakteristika jejich morfometrických parametrů
Počátkem prosince roku 2004 zaslala prostřednictvím veterinární lékařky majitelka 3,5měsíční britské krátkosrsté kočky exkrementy do Státního veterinárního ústavu v Praze k parazitologickému vyšetření. Kočku zakoupila v jednom zverimexu v Ústeckém kraji a přibližně po sedmi dnech se u zvířete objevilo průjmové onemocnění. Vzorek trusu jsme opakovaně vyšetřovali standardní koncentrační, flotačně-centrifugační metodou podle Brezy (1957) a metodou nativního preparátu podle Pavláska (1991). Kromě masívního výskytu vajíček Toxocara cati jsme nacházeli velmi početné „velké“ oocysty kryptosporidie. Majitelku kočky jsme o nálezu okamžitě informovali a současně požádali o zasílání dalších vzorků exkrementů za účelem potvrzení pozitivního výskytu oocyst kryptosporidie a zjištění průběhu jejich vylučování v delším časovém období. Upozornili jsme ji, že v současné době není k dispozici žádný účinný preparát proti těmto prvokům a vzhledem k tomu, že některé druhy Cryptosporidium mohou infikovat také člověka, aby dbala při ošetřování kočky na zvýšenou osobní hygienu. Na požádání nám majitelka kočky zaslala v období od 13. 12. 2004 do 14. 1. 2005 dalších šest vzorků exkrementů. Přítomnost oocyst prvoka jsme prokázali 6., 8., 10., 22. a 33. den od prvního zjištění, 38. den byl výsledek vyšetření exkrementů negativní.
Při 1000násobném zvětšení jsme proměřili 50 oocyst v nativním preparátu zhotoveném z homogenátu trusu. Velikost oocyst byla 8,0 – 8,1 x 4,8 – 5,0 µm, nejčastěji 8,0 x 4,8 µm. Index oocyst byl následující: délka/šířka 1,6 – 1,62 (průměr 1,6), šířka/délka 0,6 – 0,62 (průměr 0,6). Vyloučené oocysty byly ve většině případů vysporulované (obr. 2), to znamená, že uvnitř se nachází zbytkové tělísko obklopené čtyřmi sporozoity, tři granula, z nichž dvě jsou velká (1,6 x 1,6 µm) a jedno menší (0,8 µm).
Veterinární lékařka při první návštěvě diagnostikovala gastroenteritis c.a. doprovázenou zvracením; aplikovala Streptonamid, Cerucal, No-Spa a Farmatan plv. Na základě nálezu z parazitologického vyšetření bylo podáno anthelmintikum ve specialitě Pratel (praziquantelum 50 mg + pyranteli embonas 144 mg) s opakováním aplikace po čtyřech týdnech. Preparáty byly podávány v doporučovaných dávkách. Při následných recidivách (v období 14 až 30 dnů) byla použita rehydratační terapie (Rehycan). K postupné úpravě zdravotního stavu kočky došlo po zhruba po dvou měsících.
Z hodnocení parazitologických nálezů při opakovaných koprologických vyšetřeních bylo zřejmé, že podané anthelminitkum výrazně snížilo intenzitu výskytu vajíček T. cati. Nepozorovali jsme však, že by podávané preparáty měly výrazný vliv na průběh vylučování oocyst Cryptosporidium.

U některých oocyst je kolem zbytkového tělíska shluk drobných a početných granulí. Velmi ojediněle jsme nacházeli oocysty nebo blíže neurčená endogenní vývojová stadia, jejichž vnitřní obsah nebyl diferencován. Tvar oocyst je oválný, na jednom pólu jsou některé oocysty jakoby zašpičatělé a v porovnání s oocystami C. muris, C. andersoni a C. galli (ptačí druh) jsou na první pohled „štíhlejší“.

Výsledky experimentálních infekcí laboratorních myší izoláty oocyst z kočky
Izolát oocyst (KB-1/04) kryptosporidie z exkrementů spontánně nakažené kočky jsme získali obvyklým způsobem ze vzorku při prvním koprologickém vyšetřování. Perorálně jsme nakazili pět 35denních myší, u nichž byl výsledek před vlastním pokusem na přítomnost oocyst negativní, v dávce 5.105 oocyst/myš. Pět myší z téhož vrhu jsme ve stejné dávce infikovali izolátem oocyst C. muris (RN – původní izolát získaný od spontánně volně žijících potkanů) udržovaném v parazitologické laboratoři SVÚ Praha opakovanými pasážemi na laboratorních myších. Skupina stejně starých pěti myší sloužila jako kontrola.
Směsné vzorky exkrementů infikovaných myší jsme od 5. do 15. dne po infekci (DPI) koprologicky vyšetřovali v denních a potom do 70. DPI ve dvou až čtyřdenních intervalech. Kontrolní skupinu myší jsme sledovali ve čtyřdenních intervalech. První oocysty kryptosporidie u myší nakažených kočičím izolátem se objevily 11. DPI a patentní perioda trvala 42 dny. Myši infikované C. muris začaly oocysty vylučovat 10. DPI. a po dobu 68 dnů. Maximální intenzitu vylučovaných oocyst jsme u obou izolátů zaznamenali od 20. do 35. DPI. Výsledek vyšetřování kontrolních myší byl po celou dobu sledování na přítomnost oocyst kryptosporidií negativní.
Již z výsledků opakovaných koprologických vyšetřování prvního vzorku exkrementů kočky bylo zřejmé, že námi nalezené oocysty lze přiřadit do skupiny „žaludečních“ kryptosporidií. Kromě větších rozměrů oocyst oproti „střevním“ byl však definitivním důkazem teprve nález (nám již dobře známých) asexuálních a sexuálních endogenních vývojových stadií včetně oocyst (obr. 3) pouze ve sliznici žaludku experimentálně infikovaných myší utracených 25. a 37. DPI.
Uskutečnili jsme dále experimentální přenos nákazy izolátem oocyst získaným 30.DPI od laboratorních myší původně nakažených oocystami od spontánně nakažené kočky. Perorálně a ve stejné dávce uvedené výše jsme infikovali pět 40 denních myší. (Úspěšně pochopitelně proběhla i následující experimentální infekce 40 denních myší, kterým jsme perorálně a ve stejné dávce uvedené výše podali oocysty od experimentálně nakažených myší (30.DPI) izolátem získaným od kočky). Patentní perioda byla 10,5 dne a myši, v současné době 35 dnů, oocysty vylučují i nadále v poměrně vysoké intenzitě.

Stručné zhodnocení dosažených výsledků
Vůbec první nález oocyst morfometricky podobných doposud známým druhům savčích „žaludečních“ kryptosporidií u spontánně nakažené kočky, stejně jako úspěšný přenos nákazy prostřednictvím oocyst na laboratorní myši rozšiřuje hostitelské spektrum prvoka(ů) tohoto typu. Již v roce 198920 bylo japonskými autory zjištěno, že C. muris (kmen RN 66) od potkanů (Rattus norvegicus) může infikovat různé druhy laboratorních zvířat, přičemž vysoce vnímavé k experimentálnímu přenosu infekce byly 1 – 2 měsíční kočky. Dosažené výsledky našich pokusů tedy podporují jejich závěry a lze předpokládat, že britská krátkosrstá kočka byla nakažena zřejmě druhem blízkým k C. muris.
Zdroj infekce této kočky nám není znám. Majitelka ji krmí sušeným granulovaným krmivem pro kočky, masovými konzervami a podává vodovodní pitnou vodu. Kočka je držena v bytě a do kontaktu s jinými zvířaty po nákupu ve zverimexu nepřišla. Jsme si vědomi toho, že by bylo žádoucí v tomto obchodu vyšetřit alespoň některá zvířata, u nichž lze předpokládat výskyt kryptosporidií. Z vlastních zkušeností však víme, že přesvědčit prodávájící v těchto zařízeních o umožnění provedení jakéhokoliv vyšetření je velmi obtížné (majitelka nechodí s kočkou ven). Proto jsme od této snahy upustili a k získání základní informace o stupni hostitelské specifity zjištěné kryptosporidie u kočky jsme řešili experimentálním přenosem na laboratorní myši.

Závěr
V současné době budou uskutečněny genotypové analýzy izolátu oocyst získanými z prvního vyšetření exkrementů kočky i oocyst od laboratorních myší z úspěšného přenosu nákazy. Výsledky budou porovnávány s izoláty oocyst ze souběžně probíhajícího pokusu s izolátem C. muris z potkanů udržovaným dlouhodobými opakovanými pasážemi na laboratorních myších v parazitologické laboratoři SVÚ Praha, ale i dalšími izoláty oocyst C. andersoni získanými od spontánně nakažených myší domácích, velbloudů, svišťů, zubrů, ale i s druhem C. galli – ptačím druhem „žaludeční“ kryptosporidie. Teprve na základě kompletace všech dosažených výsledků, současných znalostí o taxonomii a příbuznosti jednotlivých druhů bude určena příslušnost námi zjištěné kryptosporidie u kočky.

Literatura:
1. Panciera R. J., Thomassen R. W., Garner F. M. Cryptosporidial infection in a calf. VetPathol 1971;8:479-484.
2. Nime F. A., Burek J. D., Page D. L. et al. Acute enterocolitis in a human being infected with the protozoan Cryptosporidium. Gastroenterology 1976;70:592-598.
3. Meisel J. L., Perera D. R., Meligro C., Rubin C. E. Overwhelming watery diarrhoea associated with a Cryptosporidium in an immunosuppressed patient. Gastroenterology 1976;70:1156-1160.
4. Pavlásek I. First record of Cryptosporidium sp. in calves in Czechoslovakia. Folia Parasitol (Praha) 1981;28:187-189.
5. Pavlásek I. Nejvýznamnější endoparazitární nákazy hospodářských zvířat. I.část – Kryptosporidie. II. a III. část – Giardia a smíšené parazitární nákazy. Doktorská disertace. České Budějovice, Parazitologický ústav ČSAV 1989, 599s.
6. Tzipori S., Angus K. W., Cambell I., et al. Cryptosporidium: Evidence for a single-species. Infect Immun 1980;30:884-886.
7. Iseki M. Cryptosporidium felis sp.n. (Protozoa:Eimeriorina) from the domestic cat. Jap J Parasit 1979;28:285-307.
8. Koch K. L., Shankey T. V., Einstein G. S. et al. Cryptosporidiosis in a patient with hemophilia, common variable hypogammaglobulinemia, and the acquired immunodeficiency syndrome. Ann Inter Med 1983;99:337-340.
9. Bennett M., Baxby D., Blundell N. et al. Cryptosporidiosis in the domestic cat. Vet Rec 1985;116:73-74.
10. Lewis I. J., Hart C. A., Baxby D. Diarrhoea due to Cryptosporidium in acute lymphoblastic leukaemia. Arch Dis Child 1985;60:60-62.
11. Pavlásek I. První nálezy spontánní kryptosporidiové infekce kočky domácí v ČSSR. Veterinářství 1985;35:125-126.
12. Sargent K. D., Morgan U. M., Elliot A., Thompson R. C. A. Morphological and genetic characterization of Cryptosporidium oocysts from domestic cats. Vet Parasitol 1998;77:221-227.
13. Borany-Llinares F. J., da Silva A. J., Moura I. N. S. et al. Identification of Cryptosporidium felis in a cow by morphologic and molecular methods. Appl Environ Microbiol 1999;65:1455-1458.
14. Cacci S., Pinter E., Fantini R. et al. Human infection with Cryptosporidium felis: Case report and literature review. Emerg Infect Dis 2002;8:85-86.
15. Tyzzer E. E. Cryptosporidium parvum (sp.nov.), a coccidium found in the small intestine of the common mouse. Arch Protistenkd 1912;26:394-412.
16. Tyzzer E. E. An extracellular coccidium Cryptosporidium muris (gen. et sp.nov.) of the Bystric flanda of the common mouse. J Med Res 1910;23:487-509.
17. Pavlásek I. První případy zjištění spontánní nákazy skotu Cryptosporidium muris Tyzzer (1907), 1910 v České republice. Vet Med-Czech 1994;39:279-286.
18. Lindsay D. S., Upton S. J., Owens D. S. et al. Cryptosporidium andersoni n.sp. (Apicomplexa: Cryptosporiidae) from cattle, Bos taurus. J Eukaryot Microbiol 2000;47:91-95.
19. Pavlásek I. Přehled nálezů oocyst podobných druhu Cryptosporidium murisTyzzer, 1907 u savců v České republice. GAZELLA 1999;26:31-42.
20. Iseki M., Mackawa T., Moriya K. et al. Infectivity of Cryptosporidium muris (strain RN 66) in various laboratory animals. Parasitol Res 1989;75:218-222.

Adresa autora:
Ing. Ivan Pavlásek, DrSc.
Oddělení patologie a parazitologie
Státní veterinární ústav
Sídlištní 24/136
165 03 Praha 6 – Lysolaje
e-mail: ivan.pavlasek@svupraha.cz

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *